花狭口蛙海南亚种皮肤Kph-hemolysin溶血活性及细胞毒活性研究

两栖动物皮肤中含有大量分子结构特殊、功能复杂的生物活性物质，并已部分应用于临床，如用于抗菌及烧伤治疗等。花狭口蛙海南亚种（Kaloula pulchra hainana），为海南省特有两栖动物，隶属无尾目，姬蛙科，狭口蛙属，生活于低海拔地区水沟附近，生存环境恶劣，富有大量病原体，受攻击时皮肤分泌大量白色分泌物。目前从该分泌物中获得了具有强烈溶血活性的蛋白，命名为Kph-hemolysin，该蛋白还具有较强的细胞毒活性。本项目将对该蛋白的cDNA序列进行克隆及分析，并对其溶血活性及肿瘤细胞抑制活性的机制进行深入探讨。以研究其在狭口蛙海南亚种皮肤中所承担的生物学功能，以助于揭示两栖类皮肤活性蛋白多肽的生理、毒理和药理活性，及其分子间相互作用的生物逻辑，分子机制等，解释两栖类皮肤活性蛋白多肽的生物学功能和生物环境适应机制，并为其应用于药物研究与开发打下基础。

两栖类动物皮肤中含有大量的分子结构特殊、功能复杂多样的生物活性物质，并已部分应用于临床，如用于抗菌及烧伤治疗等。花狭口蛙海南亚种为海南省特有两栖动物，生活于低海拔地区水沟附近，生存环境恶劣，富有大量病原体。受到刺激时，皮肤分泌白色粘液，少有天敌。已从其皮肤分泌物中获得一特异性的胰蛋白酶抑制剂。利用人，牛，兔，及鸡的红细胞检测，发现其皮肤分泌物具有极强的溶血活性，人红细胞对其最敏感。经阴离子交换层析和凝胶过滤层析等方法分离纯化得到两种溶血素，SDS-PAGE显示，两种蛋白表观分子量为47和22 kDa，分别命名为Kph-hemolysin1和Kph-hemolysin2。用人健康红细胞进行溶血测试，分析不同因素对Kph-hemolysin1溶血活性的影响，如不同分子量PEG（300，400，1000，2000，3400，6000），金属离子（Mg2+, Ca2+, Ba2+, Cu2+, K+），抗氧化剂等。结果显示PEG1000明显抑制其溶血活性。金属离子中Cu2+抑制作用显著，其它金属离子及抗氧化剂几乎无抑制。推断Kph-hemolysin1为孔道蛋白，该孔道蛋白在细胞膜上附着聚集形成孔道引起细胞破裂溶解，孔道直径约1.36-2.4 nm。经MTT实验检测，Kph-hemolysin1能抑制H9及C8166肿瘤细胞的生长，处理48h后，CC50分别为2.31和2.48 uM。经Kph-hemolysin1处理后的H9细胞细胞核发生凝缩，变形。提取处理后的H9细胞DNA，经电泳检测出现DNA片段化。经流式细胞仪分析3 uM Kph-hemolysin1处理48h后的H9细胞，亚二倍体细胞数为29.3%。说明Kph-hemolysin1对细胞的毒性作用是引起细胞发生凋亡。孔道蛋白是研究蛋白质与细胞受体间相互作用的模式分子，因此该研究为生物医学研究，如探讨特定细胞群(如血细胞)、膜受体分子和特定蛋白质分子在生理、病理过程中的功能提供可能的专一性强的分子探针。

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