炭疽保护性抗原 20kDa N-端片段(PA20)功能解析

The protective antigen (PA), the core moiety of anthrax toxins, transports two effector moieties of the toxins termed edema factor (EF) and lethal factor (LF) to the cytosol of mammalian cells by a mechanism that depends on its ability to oligomerize and form a transmembrane pore. After binding to its receptor, PA is proteolytically processed by furin-like enzymes into a 63 kDa C-terminal fragment (PA63) and a 20 kDa N-terminal fragment (PA20). So far, it has been believed that only PA63 involves in the transportation of LF and EF, while PA20 exerts no action. However, in our previous work we found that sole PA63 lacked the ability to facilitate LF-mediated killing of macrophage and PA20 is essential for the PA function, meaning that PA20 makes a significant contribution to PA function. What role PA20 plays in the process of PA-mediated transportation of EF and LF and how it plays remain to be investigated. Here, we intend to construct a PA mutant library by introducing truncating mutation, Ala-scanning mutation of conserved site and random substitution mutation into the PA20 part of PA, and then screen functionally defective mutants with single-point mutation. Further, the function of PA20 and the corresponding functional residues would been identified by testing the phenotypes of the mutants, like the ability to bind the anthrax toxin receptor, form an oligomer, bind LF and EF, and form transmembrane pore. This work would make great scene for thorough understanding the structure-function of PA and the pathogenic mechanism of anthrax toxins. Besides, the function formation of PA20 would be available for designing new antitoxic agents for treatment of anthrax.

保护性抗原（PA）是炭疽毒素的核心成份，它以多聚体的形式结合并转运毒素的效应成份即致死因子(LF)和水肿因子(EF)进入细胞内。在作用过程中，83kDa的PA被furin-类酶特异性地切割形成20kDa N-端片段(PA20)和63 kDa的C-端片段(PA63)。长期以来，人们普遍认为PA介导的转运过程只需PA63参与，而PA20不具备生物功能。但我们前期研究发现，单独的PA63并不能介导LF的转运，表明PA20对PA的功能至关重要，但其具体的功能却有待解析。本研究拟对PA中PA20片段进行突变，构建PA突变体库，筛选功能缺陷突变体。进而通过分析这些突变体与受体结合、形成寡聚体及结合LF和EF的能力等表型，揭示PA20功能及其结构基础，并建立PA20的作用模型。项目的实施将极大地完善人们对PA结构与功能及炭疽毒素作用机理的认识，具有重要科学价值，同时有望为抗炭疽毒素药物的开发提供新靶点。

保护性抗原（PA）是炭疽毒素关键的成份，它介导运输致死因子（LF）与水肿因子（EF）进入细胞内。PA结构与功能关系研究对于阐释炭疽致病机制，寻找防治靶点具有重要意义。本项目首先表达纯化了PA N端片段（PA20）及C端片段（PA63），细胞毒性分析表明， 单独PA63不具备生物学活性，PA20的加入可使PA63恢复功能。通过N端截短突变，证实了N端45个氨基酸构成的区域与PA20的功能相关。分析了缺失PA20的PA形成多聚体（prepore），结合LF及形成转运孔道（pore）的能力，结果表明，PA20不参与prepore与pore的形成。分子叠合分析表明，PA20的切除不引起PA63结构的改变。体外酶切分析表明，furin酶切产生的N端片段分子量为20 kDa，符合理论预期；而trypsin酶切产物分子量约为15 kDa，明显比PA20理论值小，表明体外利用furin更接近体内激活过程。为了筛选PA20随机突变体库，本项目建立了一种基于细胞透性化提取E.coli 可溶性蛋白技术，利用终浓度为0.5 mg/mL硫酸多粘菌素，0.05%（v/v）的Triton X-100及5 mM EDTA溶液处理E.coli细胞，4°C轻柔振荡20 min后离心，即得到含有大量目标蛋白的上清。与传统超声或机械破碎法相比，该方法具有温和、高效、廉价等优势，不仅适用于重组蛋白纯化，亦为突变库的筛选提供了高通量平台。利用该方法，我们建立了炭疽水肿因子(EF)快速纯化方法。基于EF基因的密码子使用偏好，选择菌株E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL为表达宿主，实现了EF可溶性高效表达，透性化处理可有效抽提可溶性重组蛋白；利用亲和层析一步法纯化得到了高纯度的EF；EF可与保护性抗原(PA)结合形成水肿毒素，该毒素能够急剧提高CHO-K1细胞中cAMP的浓度。本研究首次证实了PA20对于维系PA功能必不可少，打破了“PA20无功能的传统认识”，初步解析了PA20功能，为进一步研究PA结构-功能关系提供了新的视角；建立了高效温和的E.coli可溶性重组蛋白提取方法，为重组蛋白的纯化与蛋白突变体的高通量筛选提供了平台；建立了一种高效快速制备具有生物活性的EF的方法，为炭疽相关研究工作提供了新的选择。

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