超高灵敏度全蛋白质定量测试平台及相关技术研究

The limitation of cell line based in vitro system lies in the fact that these systems are incapable of recapitulating how the microenvironment affects the regulation of the cells. Thus, understanding how the systematic diseases, such as cancer, emerge, evolve and spread requires the direct probing of the target cells from clinical samples or in vivo animal model. The heterogeneity nature of the tissue samples makes it necessary to enrich the target cell types from the sample before the proteomic analysis. Otherwise, the difference of protein expression level lies in different cell types might shield the difference between the diseases and control samples. After the enrichment of certain cell types, the sample for proteomics analysis is rare. When starting material is rare, the immaturity of the proteomic profiling platform can only provide ~30% coverage of human proteome, which makes it very difficult to find those important regulatory proteins in low expression level. In order to solve this problem, our group propose to design and construct a next generation genome wide proteome quantification (GWPQ) platform for small amount of samples. Based upon the previously published system, we propose to further improve GWPQ platform in three ways to fulfill the requirement for GWPQ with 1E4 cells, 1) sub-nanospray based upon 10 μm i.d. nano chromatography can maximize the detection efficiency for mass spectrometry, 2) online integrated protein extraction and digestion system can minimize the lost for sample preparation, 3) online three dimensional RP-RP-RP platform can maximize the resolving power for peptides separation.

对于复杂的多细胞系统，临床组织的样品或疾病动物模型的全蛋白质组研究能够帮助人类了解系统性疾病，特别是癌症，产生发展以及转移的机制。由于组织样品往往由不同类型的细胞所组成，进行有效的蛋白质组分析需要对单一类型的细胞进行比较，然而能够分离出来的单一类型细胞往往非常稀少。目前对于小细胞量的蛋白质组学研究仍然停留在初期阶段，对蛋白质组的覆盖率仅能达到30%左右，覆盖率不足影响后续的分析，使得那些至关重要的调控通路的很难被发现。针对这一问题，本课题组在已发表的全蛋白定量平台的基础上，通过1）基于10微米内径色谱柱亚納升级电喷雾的色质联用系统，2）能与流式细胞仪在线相连的蛋白提取、酶切系统，3）全在线三维反相色谱系统。三个不同的方向去全面解决蛋白质组测试过程中的灵敏度问题，达到对~1E4细胞样品的全蛋白质定量测定。

蛋白质是细胞内进行生物活动的最重要的物质。蛋白质组学的最终目标是研究细胞中的所有蛋白质，了解它们是如何调节各种生物活动的。与DNA/RNA不同的是，目前还没有有效的方法来扩增蛋白质，这使得检测那些在功能调控中起重要作用但通常在低表达水平的重要激酶、跨膜受体或转录因子变得非常困难。缺乏对这些调控蛋白的检测能力削弱了蛋白质组学分析的价值。因此，开发能够在最低表达水平检测这些蛋白质的新型蛋白质组学平台，对于最大限度地探索疾病的发病机制具有重要意义。..在这个项目中，我们致力于进一步推动超低流量色谱系统的极限。用1.8微米C18色谱填料填充的15微米内径熔融石英毛细管作为多肽分离的色谱柱。它有助于将流速调低至~1nL/min。借助超低流速实现的更高电喷雾效率，15微米内径的毛细管色谱柱能够在亚阿摩尔水平上为样品提供比25微米内径的毛细管色谱柱高3-4倍的信号响应，从大约10个细胞中可以鉴定出的蛋白质数量增加了30%。..这种超灵敏的蛋白质组学平台可以用于蛋白质与DNA相互作用的研究。以提供蛋白质与DNA相互作用的全面信息，特别是针对特定DNA位点的信息。通过生物素化的Dcas9和针对目的基因座的SgRNA可以从约30亿个碱基对中富集目标基因座。基于15μm I.D.柱的超灵敏蛋白质组学平台提供了对每个细胞只有1-2个拷贝的蛋白质的灵敏检测。该系统已成功应用于血红蛋白β和γ的启动子和增强子区域的蛋白质分析。在本实验中，我们成功地鉴定了GATA1、NFE2和TAL1等先前已知的转录因子。更为关键的是，我们首次发现了两个新的因子NUP98和NUP153与血红蛋白β和γ的启动子区域结合。并且发现这两个蛋白对血红蛋白β和γ的转录起到重要的调控作用。..我们也利用超灵敏的蛋白质组学平台对HIV感染系统进行了深入的蛋白质组学分析。从1E5成功和未成功感染CD4+T的细胞中鉴定和定量了14000多种蛋白质。蛋白质组的深度覆盖使我们能够交叉引用干扰素和阳性选择数据库来确定新的限制因子PSGL-1。后续的实验也证实了该蛋白对HIV的感染有显著的抑制作用，有望成为新的治疗艾滋病的药物靶点。

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