猪胚胎干细胞向雄性生殖细胞诱导分化及其调控机制研究

The establishment of technical systems of naïve porcine embryonic stem cells (ESCs) derivation and functional gametes induction from ESCs could not only provide good animal models for treatment of human diseases such as infertility, but also provide the theory basis for the pig stem cell breeding systems establishment. Based on the previous research in our lab, the project plans to derive porcine ESCs and then directionally differentiate them into male germ cells. First, we will analyze and confirm specific expression genes in porcine blastocyst inner cell masses, and generate porcine ESC lines through optimization of porcine ESCs culture systems in vitro. Second, we will analyze and confirm porcine primordial germ cells (PGCs) specific genes, construct the reporter systems and then screen key regulation factors of PGCs development. The technical systems of induction of male germ cells from porcine ESCs could be thus established and optimized. Finally, we will detect the developmental potential of the induced germ cells in different stages, including the detection of germ cell marker genes and proteins expression, the epigenetic detection and the functional gametes generation after meiosis. We wish to get functional gametes and establish the technical standards of induction of male germ cells from porcine ESCs, which could provide theory basis and technology supports for the application of clinical medicine and livestock breeding in the future.

猪初始态胚胎干细胞（ESCs）的建系及其诱导分化为功能性配子技术体系的建立，不仅可以为人类不孕不育等疾病的治疗提供良好的动物模型，还可以为未来猪干细胞育种体系的建立提供理论依据。本项目基于本实验室前期研究基础，拟开展猪ESCs的建系及其定向分化为雄性生殖细胞的研究。分析和验证猪囊胚内细胞团特异表达基因，优化猪ESCs体外培养体系，建立猪ESCs系。检测和验证猪原始生殖细胞（PGCs）特异标记基因并构建其报告载体，筛选调控PGCs发育的关键因子，建立猪ESCs定向分化为雄性生殖细胞的技术体系。对诱导不同阶段的生殖细胞进行生殖细胞特异基因和蛋白的检测、表观遗传因子的检测以及减数分裂为功能性精子等发育潜能的检测，以期获得有功能的精子，并建立猪ESCs定向分化为雄性生殖细胞的技术标准，阐明其调控机制，为未来在临床医学和家畜育种中的相关应用提供理论依据和技术支持。

猪作为我国畜牧业最重要的家畜之一，它的高新技术育种直接影响未来我国猪业，甚至畜牧业的发展，同时，猪也是研究人类生理和病理的理想动物模型。尽管自20世纪90 年代以来一直尝试建立猪的胚胎干细胞系，但始终未能获得可以长期稳定传代的猪胚胎来源干细胞系。.本研究首先基于猪早期胚胎E0-E14单细胞转录组测序结果，解析了猪上胚层发育过程中的多能性变化过程及相关信号通路，以此为指导，筛选获得猪上胚层干细胞化学培养体系 3i/LAF，并从E10原肠胚前上胚层中高效建立了可稳定传代的上胚层干细胞系，该细胞系具有与体内原肠化前上胚层相似的转录组特征，具备典型的多能性特征，高低代次细胞系之间保持了正常核型和极低的基因组突变比例，还可以很好地耐受至少三轮基因编辑。令人惊喜的是, 经过连续基因编辑的猪上胚层干细胞仍然可以作为供体细胞通过体细胞核移植产生成活的克隆仔猪，且克隆效率与成纤维细胞相当。紧接着，本研究采用CRISPR/Cas9介导的定点插入技术，成功构建SOX17-tdTomato和DAZL-EGFP荧光报告猪上胚层干细胞系，通过对tdTomato阳性细胞的跟踪观察，确定了中内胚层和原始生殖细胞特化所需培养体系和特化发育过程。将猪原始生殖细胞样细胞与CD1小鼠E13.5雄性胎儿性腺体细胞异种重构成类睾丸组织，并进行肾荚膜移植，可见聚合物形成曲细精管样结构，且原始生殖细胞进一步发育成精母细胞样细胞。.综上所述，本研究建立了可长期稳定传代且耐受连续基因编辑的猪上胚层干细胞，以此为供体细胞成功产生克隆仔猪。同时，本研究还开发了一种体内外相结合系统，实现了猪上胚层干细胞分化成生殖细胞过程。这不仅证明了pEpiSCs在体外分化成雄性生殖细胞的能力，而且建立了重组猪雄性生殖细胞发育的基本框架，为大动物干细胞育种奠定了扎实的理论基础，同时提供了理想细胞资源和可参考的体外分化模型。

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