全人源屋尘螨特异性单链抗体的构建及应用

House dust mites are a major cause of allergic asthma in China, and the allergen combine with the specific IgE on the sensitized cell is the critical procedure of type Ⅰallergic reaction. The aim of this study is to cure the allergic disease. we design a kind antibody targeting the house dust mite, utilize the gene clone and phage antibody library technology, construct the all human single chain antibody (scFv) that can compete with sIgE combine to house dust mite allergen. And the scFv and house dust mite combine together, formed scFv-allergen complex. This kind of complex can be exist in the immune system, but this complex can not combine with the IgE Fcε receptor which express on the surface of mast cell and basophilic granulocyte, so they can not induce immune response. And the scFv-allergen complex can be removed by the the macrophagocyte, so we can control the house dust mite allergic disease from the sensitized cell activation. The gene clone and phage antibody library technology will be employed to construct the scFv antibody. The enzymes linked immunosorbent assay, immunoblotting and surface plasmon resonance will be employed to test the affinity between scFv antibody and house dust mite. The IgE-facilitated allergen binding assay and basophil activation test will be employed to test the blocking function of scFv antibody.

尘螨是我国过敏性哮喘患者的最主要变应原，而变应原与致敏细胞上的特异性IgE偶联是诱发过敏性哮喘的关键环节。本研究从治疗过敏性哮喘出发，以屋尘螨变应原为靶点，设计能与IgE竞争结合屋尘螨变应原表位的人源scFv抗体，使其与屋尘螨变应原特异性结合，形成scFv抗体-变应原复合物，该复合物即使在人体中存在，却不能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE Fcε受体结合，因而无法诱发免疫应答反应，而无害的scFv抗体-变应原复合物可被巨噬细胞等吞噬清除，从而从源头控制屋尘螨特异性变态反应性疾病的发生。本研究将采用基因克隆、噬菌体抗体库展示技术等构建并表达scFv抗体，以酶联免疫吸附试验、免疫印迹及表面等离子共振检测纯化的scFv抗体与屋尘螨变应原的亲和力，以IgE易化的变应原结合试验及嗜碱性粒细胞活化试验检测其在效应细胞层面的功能。为尘螨过敏等变态反应性疾病的治疗提供方法。

尘螨是我国过敏性哮喘患者的最主要变应原，构建scFv抗体阻断尘螨与肥大细胞等效应细胞上的IgE Fcε受体结合或可减少免疫应答反应。本研究首先论证构建scFv抗体的可行性，从经屋尘螨皮下特异性免疫治疗（SCIT）的哮喘患者血清中制备Fab抗体，并进一步验证其功能，为构建scFv抗体提供了依据。主要研究结果1：经SCIT后，患者血清尘螨特异性IgG4（sIgG4）水平在治疗3个月后开始显著增高，经过1年到3年治疗后，sIgG4水平有37-73倍的升高，并且sIgG4的升高与临床症状的改善显著相关。研究结果2：构建了IgE易化的变应原结合试验（IgE-FAB）来检测sIgG4/Fab/scFv抗体的功能。IgE-FAB在SCIT中的研究表明：SCIT治疗16周后，血清可以显著抑制Der p-sIgE复合物与EBV-B细胞的上的IgE受体CD23的结合（P<0.01）。药物治疗组相对结合率与治疗前比较，差异无统计学意义（P>0.05）。同时，在治疗52周、104周、156周，IgE-FAB与临床症状相关。研究结果3：构建了嗜碱性粒细胞活化抑制试验以检测sIgG4/Fab/scFv抗体抑制嗜碱性粒细胞活化的能力。在SCIT中的研究表明：以0.15 μg/ml屋尘螨变应原与全血孵育时，SCIT组从第12周开始显著阻断碱性粒细胞的表达CD63（p<0.05）；药物组无显著变化。尘螨sIgG4与嗜碱性粒细胞活化抑制试验的回归分析表明：SCIT组的sIgG4与嗜碱性粒细胞活化抑制试验在全部时间点上显著相关（R2=0.58, p<0.0001），表明sIgG4是阻断嗜碱性粒细胞活化的主要抗体。研究结果4：通过Protein G亲和层析法从尘螨SCIT患者血清中纯化出尘螨sIgG4；并以木瓜蛋白酶酶解sIgG4后，获得Fab抗体片段；以胃蛋白酶酶解sIgG4后，获得了F(ab')2片段。以IgE-FAB及嗜碱性粒细胞活化抑制试验证明：尘螨sIgG4抗体的Fab、F(ab')2片段可以阻断IgE与屋尘螨变应原的结合，以及抑制屋尘螨活化嗜碱性粒细胞。研究结果5：收集了30例经屋尘螨SCIT 3年的患者的外周血淋巴细胞，并且提取总RNA经逆转录成cDNA，为构建尘螨特异性阻断抗体打下了基础。

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