CRISPR介导基因修复治疗β-地中海贫血家兔模型及其治疗效果与安全性研究

β-thalassemia is one of the most common genetic blood diseases and is caused by either point mutations or deletions in the β-globin (HBB) gene. To date, the most effective cure for β-thalassemia is allogeneic hematopoietic stem cells (HSCs) transplantation. However, fully matched donors are rare for β-thalassemia patients, which seriously limits its application in clinical therapy. The advance of gene editing technology provides insights to the treatments for monogenic disorders through genetically correction of patient-derived adult stem cells. Previously, we have established the seamless correction of the β41/42 (-TCTT) deletion mutation in β-thalassemia iPSCs with remarkable efficiency. However, the safety of iPSCs for clinical application remains unknown. Therefore, taking the advantage of β-thalassemia rabbit models which we recently established, we intend to utilize the latest high-fidelity Cas9/gRNA ribonucleoprotein and adeno-associated targeting virus vectors to achieve the correction of HSCs for therapy of β-thalassemia. On the one hand，we will reveal the validity of genetically correction of β-thalassemia HSCs by in vitro HSCs differentiation and in vivo bone marrow transplantation. On the other hand, using the high-throughput sequencing technology, we will
comprehensively analyze the effect of gene correction on the transcriptome and unexpected mutations in the genome of HSCs, and blood transcript profile of the transplanted rabbit. This study will provide first large animal experimental data for the clinical treatment of β-thalassemia via genetically correction of patient-derived HSCs.

β-地中海贫血是由于β-珠蛋白基因突变导致的血液类遗传病。造血干细胞移植是目前最有效的治疗方案，但供体来源限制了其临床应用。利用基因编辑技术修复成体干细胞进行自体移植治疗具有广阔应用前景。前期研究中我们建立了一种高效、无痕的基因修复诱导多能干细胞（iPSCs）体系，但iPSCs临床应用的安全性问题尚未解决。本项目拟在我们已建立的β-地中海贫血家兔模型基础上，利用Cas9/gRNA核糖核蛋白复合体结合腺相关病毒基因打靶载体，开展造血干细胞基因修复治疗β-中海贫血的研究。一方面通过造血干细胞体外分化实验和体内骨髓移植实验评估基因修复造血干细胞治疗β-地中海贫血的有效性；另一方面，通过高通量测序技术从造血干细胞转录组、血液转录谱、全基因组非特异性突变等方面深入分析基因修复造血干细胞的安全性。本研究将为利用基因靶向修饰技术修复β-地中海贫血病人自身来源的造血干细胞进行临床治疗提供动物实验依据。

β-地中海贫血是我国南方地区高发的由于β-珠蛋白（HBB）基因突变导致的血液类遗传病，临床尚无有效治疗手段，亟需探索新的治疗策略, 利用基因编辑技术修复造血干细胞进行自体移植治疗具有广阔应用前景，但是需要动物模型进行安全性和有效性评估。已报道的β-地中海贫血动物模型主要是小鼠，但由于小鼠与人遗传背景相差较大，小鼠有两个β珠蛋白基因，需要同时敲除b1和b2基因的杂合小鼠才表现为很轻的地贫表型。家兔与人都只包含一个β珠蛋白基因，同源性高，遗传背景上能更好的模拟β-地中海贫血病人由于HBB单基因点突变造成的典型地贫表征。此外，家兔具有体型适中，利于采样操作和大样品量数据的收集等优点。本课题中我们利用 CRISPR/Cas9 基因靶向修饰技术结合胚胎显微注射技术成功获得了 HBB2 基因修饰的β-地中海贫血家兔模型，通过血常规检测、红细胞形态、免疫染色等多项检测证明β-地中海贫血杂合子家兔具有显著的地贫表型。在此基础上，我们利用最新的基因编辑技术CRISPR/Cas9的核糖核蛋白复合体，通过优化一系列打靶过程中的试验参数，建立了一套体外高效基因编辑家兔造血干细胞的技术体系，基因敲除效率高达70%以上，再通过 CRISPR 结合腺相关病毒载体建立了通用型HBB突变位点基因编辑修复体系，为了有效富集基因编辑的造血干细胞，在AAV 靶向修饰载体中引入EGFP 表达框，将细胞流式分选获得EGFP 阳性细胞进行体外单克隆分化、转录组分析以及体内骨髓移植，分析基因编辑对家兔胎儿 CD34+造血干细胞体外和体内发育的影响。在分化的不同阶段打靶前后的细胞其红系分化效率未见明显差异，吉姆萨染色实验显示打靶后的细胞在不同的分化阶段其均能形成正常的细胞形态，表明基因打靶体系对HSPCs体外功能无明显影响。本课题利用RNP及rAAV建立的针对β地贫常见突变位点的通用型基因打靶修复体系为基因编辑技术介导的同源重组修复治疗β地贫提供动物实验依据，并为临床转化奠定了理论基础。

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