RNA结构对斑马鱼胚胎发育的调控机制研究

The regulation of RNA processing and metabolism in embryonic development is crucial to the normal development of the embryo. RNA structure and modification play important regulatory roles in RNA processing and metabolism. Recent studies have shown that RNA m6A modification regulates maternal mRNA decay in zebrafish embryonic development via its binding protein YTHDF2. RNA secondary structure regulates RNA function and RBP binding, but how it affects the mRNA function and regulates the embryonic development has not been reported. In our pioneering studies, we found that the mRNA m5C modification regulates the formation of the secondary structure, and both mRNA m5C modification and secondary structure show a high degree of dynamic changes during zebrafish embryonic development. Meanwhile, we further revealed that these dynamic changes display a significant correlation with translation, stability and decay of the maternal mRNA, suggesting that they may play important roles in regulating the embryonic development of zebrafish. In this project, by integrating multi-cross-disciplinary technologies, including molecular and cellular technologies, biochemistry, epitranscriptome, RNA structurome and bioinformatics, etc., we aim to clarify the molecular mechanism of RNA secondary structure in regulating zebrafish embryonic development.

胚胎发育过程中mRNA的加工代谢对胚胎的正常发育至关重要。RNA结构及修饰对mRNA加工代谢均起着重要的调控作用。近期研究表明，RNA m6A修饰可以通过其结合蛋白YTHDF2调控斑马鱼胚胎发育过程中的母源mRNA降解。RNA二级结构调控RNA功能的发挥及RNA结合蛋白的结合，但它在胚胎发育过程中对mRNA功能的调节及对胚胎发育过程的调控尚未有相关报道。在前期研究中，申请人发现mRNA m5C修饰可以影响二级结构的形成，并揭示在斑马鱼的胚胎发育过程中mRNA m5C修饰和二级结构呈现出高度的动态性，且这种动态性与母源mRNA的翻译、稳定性和降解具有显著的相关性，这表明RNA二级结构对斑马鱼的胚胎发育过程可能起到了重要的调控作用。本项目综合利用分子细胞、生物化学以及表观转录组、RNA结构组、生物信息学等多学科交叉技术，阐明RNA二级结构调控斑马鱼胚胎发育的分子机制。

首先解析了斑马鱼早期胚胎发育过程中RNA结构特征与调控机制。通过icSHAPE技术建立了斑马鱼胚胎发育过程中0-6小时的4碱基RNA结构图谱。进一步分析发现RNA结构在斑马鱼胚胎发育早期0小时(fertilized egg) 至 6小时(shield)之间呈现高度动态性，具体表现为RNA结构在受精后迅速开放并逐渐关闭至2 小时(64-cell)，之后再次逐渐开放并趋于平稳。对RNA结构动态区域进行motif分析发现该区域富集了大量的与母源合子转换相关的顺式作用调控元件，暗示RNA结构的动态变化在母源合子转换过程中可能发挥了重要作用。研究进一步揭示了RNA解旋酶Ddx3调控受精后RNA结构开放及斑马鱼胚胎发育过程。. 我们同时揭示了RNA结合蛋白Elavl1a以RNA结构依赖性的机制影响斑马鱼母源RNA稳定性调控斑马鱼胚胎发育。研究发现RNA结构动态变化区域显著富集Elavl1结合motif。通过iCLIP和icSHAPE数据的联合分析发现Elavl1结合位点其RNA结构更加偏向于单链。同时，通过使用含有Elavl1a结合序列RNA探针进行体内外RNA pulldown，以及凝胶阻滞实验（EMSA）来验证Elavl1a对RNA结构的结合偏好性。这些结果都证明了无论在体内还是体外，Elavl1a更加倾向于结合单链RNA。进一步研究发现Elavl1a可以通过结合RNA上的顺式作用元件对母源RNA起到稳定性调控作用。Elavl1a结合位点RNA结构的形成则可以抑制Elavl1a与母源RNA的结合，从而影响到这些母源RNA的降解。通过注射elavl1a翻译起始位点的反义morpholino来抑制elavl1a mRNA翻译的实验来检测Elavl1a是否对胚胎发育起到重要作用，表型实验和转录组测序结果均表明Elavl1a通过调控母源RNA的稳定性对斑马鱼早期胚胎发育起到了至关重要的作用。研究首次阐明RNA结构通过影响Elavl1a对母源RNA的结合及稳定性维持调控早期胚胎发育过程，揭示了RNA结构作为新的作用方式调控胚胎发育，这种RNA结构调控可能在其他生物学过程中也发挥着重要作用，为生物学调控机制解析提供了新的研究方向。

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