microRNA在人类胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中的调控作用及分子机制研究

In our previous study, we have successfully induced human embryonic stem cells (hESCs) into insulin-producing cells (IPCs) in a stepwise process which recapitulates islet organogenesis. However, the IPCs are immature islet β cells and are required to promote their maturation in the future study. MicroRNA (miRNA) has been proved to play important roles in embryogenesis, cell fate, growth control and islet functions. Our very recent study showed that several miRNAs, such as miR-375 and miR-7, were expressed at the stage-specific patterns during the differentiation of hESCs into IPCs. Therefore, we presume that the miRNAs might take part in islet cell differentiation and maturation. In this project, we intend to detect the miRNA expression profiles during the differentiation process by using the high-throughput screening technology, compare them with human adult islet cells and verify the results of significantly differential expression by realtime PCR. Thereafter, we plan to over- or down-express the miRNAs which show specific patterns, investigate the expression of their potential target genes, monitor the dynamic changes of specific markers at different stages during the differentiation and confirm the target genes of the miRNA by dual-luciferase reporter system. Our project will be helpful to clarify the function of the miRNAs and understand the underlying mechanisms of miRNA actions during the differentiation of hESCs into IPCs, and will be also useful to establish high-efficiency differentiation protocol.

本课题组在前期研究中已成功将人类胚胎干细胞（hESCs）诱导分化为胰岛素分泌细胞，但该细胞并非成熟的胰岛β细胞。microRNA（miRNA）已被证实在胚胎发育、干细胞分化及胰岛功能中发挥重要作用。我们最近的研究显示，多个miRNAs在hESCs向胰岛素分泌细胞分化过程中呈阶段特异性表达，推测其在胰岛细胞分化和成熟中具有重要作用。本课题拟采用高通量测序技术分析hESCs分化过程中miRNA表达谱的变化，并与正常成人胰岛细胞miRNA表达谱进行比较。对于表达有显著差异的miRNA，通过上调或下调其表达，观察下游靶基因和细胞分化阶段特异性标志物表达在分化过程中的动态变化，分析干预前后细胞的胰岛素分泌功能变化；并且通过双荧光素酶报告基因分析方法，确认miRNA调控的靶基因。本课题将有助于明确miRNA在hESCs向胰岛素分泌细胞分化过程中的调控作用及其潜在机制，为建立高效诱导分化方案提供新思路。

人胚胎干细胞（hESCs）可定向分化为胰岛细胞，但多数分化方案形成的胰岛细胞并非完全成熟。miRNAs已被证实在胚胎发育、干细胞分化及胰岛功能中发挥重要作用。然而在干细胞向胰岛细胞分化过程中是否存在miRNAs调控，有哪些miRNAs参与调控，这些miRNAs是如何发挥作用的呢？目前报道较少。本课题采用高通量测序分析hESCs分化过程中miRNA表达谱的变化，并与正常成人胰岛进行比较。结果显示，第四与第五阶段分化细胞间miRNA表达谱有较大的相似性，而与成人胰岛则存在较大不同。我们选取若干差异表达的miRNAs（如miR-375、miR-7、miR-34a、miR-146a等）进行qPCR动态分析，结果显示这些miRNAs在hESCs向胰岛细胞分化过程中呈阶段特异性表达，推测其在胰岛细胞分化和成熟中具有重要调控作用。通过构建miR-375过表达和敲减的慢病毒载体显示miR-375可上调胰腺前体细胞标志物（如Ngn3和Pdx1）的表达，下调胰岛细胞成熟标志物（如Nkx6.1和Pax4）的表达，提示miR-375可调控胰腺前体细胞向胰岛细胞分化。此外miR-375过表达对胰岛素分泌影响不大；miR-375敲减则可显著加强高糖刺激下的胰岛素分泌反应。生物信息学分析预测miR-375可作用于Hnf1β和Pax6的启动子区，Western结果显示过表达miR-375可下调二者蛋白水平。荧光素酶报告基因分析显示野生型Pax6可使miR-375诱导的荧光活性降低，而突变型Pax6对miR-375诱导的荧光活性无明显影响，提示miR-375确实存在与Pax6启动子区3’UTR的直接作用。此外miR-7可调控Pax6，miR-9和miR-145可调控FoxO1，从而参与hESCs向胰岛细胞分化。本课题阐明了特定miRNAs在hESCs向胰岛细胞分化过程中的调控作用及其潜在机制，为建立高效诱导分化方案提供新思路。本项目共发表SCI论文13篇（其中IF>5的SCI 4篇），中文核心期刊论文23篇；相关成果获得2016年北京市科技奖（公示中）；培养研究生20名（已毕业8名，其中博士5名硕士3名），在站博士后1名；课题成员中有3人获得青年基金项目；举办国家级和北京市级培训班6次，参加23次国内外学术会议，进行14次大会报告和专题发言，很好地将研究成果进行了推广，加强了在国际和国内的学术影响力

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