RUNX2-miR320a-BMP6以前馈环模式调控人类成骨细胞分化的机制研究

The aims of this study is to demonstrate the mechanism of miR-320a regulating human adipocyte differentiation by directinal targeting BMP6 in vitro induced from human mesenchymal stem cells (hMSCs).We will obeserve the expressions of miR-320a and candidate target genes (BMP6) during adipocyte differentiation through Realtime PCR and immnoblotting, and the effects on the processes of adipocyte differentiation after miR-320a, BMP6 overexpression or silencing, respectively, and their corresponding relationships.Then BMP6 will be identified to be the target genes of miR-320a by the SuperLight Luciferase Reporter Gene assay. RNA-seq profiling will be performed to check the significant signal pathways related adipogenesis after BMP6 overexpression or silencing, to explore the molecular mechnism of BMP6 regulating adipocyte differentiation. This project will offer valuable information on treatment of the osteoporosis and further understand how miR-320a regulates adipocyte differentiation induced from hMSCs.

本研究以体内外二个研究层面为视角，沿着前馈环调控成骨分化的思路，朝着阐述RUNX2-miR320a-BMP6以前馈环模式调控成骨分化的机制的目标展开工作。体外研究以hMSCs成骨分化的过程为对象, 首先明确RUNX2、miR320a和BMP6在成骨分化中趋势及对应关系，并通过反复使用过表达和干扰目标基因的技术手段，运用定量PCR、ChIP、免疫印迹和双荧光素酶等方法确认彼此对应的靶向关系，证实RUNX2-miR320a-BMP6构成前馈环模块，采用成骨表型鉴定和成骨特异基因检测相结合的方法，评价该模块调控成骨分化的能力，并通过体内移植不同表达水平miR320a的hMSCs异位成骨实验，验证前馈环中具有开关作用的miR320a体内成骨效能，系统阐述RUNX2-miR320a-BMP6以前馈环模式调控人类成骨细胞分化的机制，最终为研究骨质疏松这类骨的退行性疾病发病机制奠定坚实的理论基础。

本项目朝着阐述RUNX2-miR320a-BMP6以前馈环模式调控成骨分化的机制的目标展开工作。已完成研究证实RUNX2、miR-320a和BMP6在成骨分化中的表达趋势符合预期，同时，RUNX2可转录调控BMP6，其有效的结合位点位于转录起始点上游序列为TGTGGT，为BMP6的转录调控机制和RUNX2作为关键转录因子转录调控成骨分化、骨发育和骨相关疾病提供了新思路。项目还对前期高通量数据的进一步分析，通过信号通路作用网络和基因作用网络，获得对成骨分化过程有重要意义的信号通路和基因，为成骨分化的深入研究提供了新的方向。同时，为了解决项目实施过程中碰到的问题，开展了hMSC无血清培养，证实无血清培养的hMSC从使用安全性、便利性、数量和质量等方面，均优于有血清培养的hMSC，且具有良好的成骨和成脂分化诱导效能，可以替代有血清培养的hMSC进行后续实验，为项目组乃至团队hMSC成骨/成脂分化机制的深入研究奠定坚实基础。

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