atp7b基因外显子编码区变异致mRNA异常剪接的致病机制研究

Wilson’s disease (WD) is an abnormal copper metabolism disorder that is caused by atp7b gene mutation. Up-to-date, there are clear limitations in the mechanism research about atp7b gene mutation dysfunction. They just studied the changes of amino acid caused by mutation, but overlooked the mRNA abnormal splicing. According to the current research dates, there are 25%～50% of known mis-sense and nonsense disease-causing mutations alter functional splicing signals within exons. Forty different mutations, including 14 novel mutations, were identified in our preliminary study. 38 mutations of them located in exon coding area and most of them unknown the dysfunction. Addition to, there are distinctive difference between the genotype and the phenotype in some patients. These dates further suggest that the current researches have limitation. By gene sequencing, reverse transcription sequencing, exon trapping, RT-PCR etc. technology, we can find the abnormal mRNA splicing and study the error frequency and dysfunction caused by mutations which located in exon coding area. The present study therefore aimed to broaden the knowledge of pathogenesis of WD and contribute to diagnosis and future therapy of WD.

肝豆状核变性（WD）是我国非病毒性肝炎较为常见的肝病致病原因， 为atp7b基因突变导致的铜代谢异常的疾病。目前已有的atp7b基因突变的致病机制的研究方法存在明显的局限性，仅考虑了基因突变对蛋白序列的影响，而忽视了突变对mRNA剪接的影响。据目前数据显示，至少25%～50%的人类致病突变会影响基因剪接。我们的前期研究共检测到atp7b基因40种不同的变异，38种突变位于外显子编码区，其中大部分突变对功能的影响至今未知，另外部分患者也存在临床表型与基因表型明显不一致的情况，这进一步提示目前的研究方法存在不足的地方。本研究拟从外显子编码区突变对mRNA剪接的影响入手，利用基因测序、RNA逆转录测序、exon trapping、RT-PCR等技术发现异常剪接体，并从突变导致异常剪接出错的频率及功能上两方面入手解释突变的分子致病机制，加深我们对WD发病机制的认识，为临床诊断及将来的治疗提供依据。

肝豆状核变性（WD）为我国非病毒性肝炎较为常见的肝病致病原因，为ATP7B基因突变导致的铜代谢异常的疾病。目前已有的ATP7B基因突变的致病机制的研究方法存在明显的局限性，仅考虑了基因突变对蛋白序列的影响，而忽视了突变对mRNA剪接的影响。据目前相关研究的数据显示，至少25%～50%的人类致病突变会影响基因的剪接。本研究从外显子编码区突变对mRNA剪接的影响入手，利用基因测序、RNA逆转录测序、exon trapping、RT-PCR等技术发现异常剪接体，并从突变导致异常剪接出错的频率及功能上两方面入手解释突变的分子致病机制。项目研究已经建立成熟的ATP7B基因突变的生物信息学分析方法。已经开展临床ATP7B基因检测确诊WD病人41例，发现变异28种，其中新突变6个扩展了ATP7B基因突变谱，为我们认识WD的分子致病机制提供了数据支持；通过对部分WD病人及正常肝脏组织mRNA逆转录PCR测序分析未发现外显子区基因变异对mRNA异常的影响；构建了ATP7B基因外显子捕获质粒并完成正常及基因突变剪接捕获实验，为今后研究ATP7B剪接核心序列剪接突变的分子致病机制研究提供了新手段；构建了ATP7b正常及体外基因突变的真核表达克隆，并在 HepG2肝癌细胞及 CHO 细胞的真核表达，建立研究突变蛋白的稳定性、亚细胞定位及铜毒性试验的研究方法，可为今后ATP7B分子致病机制的研究提供基础。

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