外泌体介导的人脱落乳牙牙髓干细胞“对话”小胶质细胞治疗创伤性脑损伤的机制研究

With no effective clinical treatments, traumatic brain injury (TBI) caused serious damage to patients; stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) are proved to have the potential of treating peripheral nerve injury. In our early studies, it is confirmed that SHED could talk to microglia (MG) through its secretion of exosomes to repair nerve injury in rat models. MG is considered to be a major participant in the neuroinflammatory response and can play an immunomodulatory role by M1 / M2 polarization. We believe that some of the "key miRNAs" in SHED exosomes can treat TBI by immunoregulatory effects through downstream target genes affecting MG polarization-related pathways. Accordingly, this study intends to use miRNA chips combined with bioinformatics analysis to screen out the “key miRNAs” that play important roles in exosomes, and further verify whether the “key miRNAs” play roles in the treating TBI by gain and loss of function. We further explore whether IL-4 / IL-13 or other pathways are involved in the regulation of microglia polarization thus to provide a new theoretical basis for the application of SHED or SHED exosomes in the repair of TBI.

创伤性脑损伤（TBI）危害严重，目前尚缺乏有效的临床治疗手段；人脱落乳牙牙髓干细胞（SHED）来源丰富，有治疗外周神经损伤的潜能。我们前期研究发现，SHED可通过其分泌的外泌体“对话”小胶质细胞(MG)，参与神经损伤的修复。MG被认为是神经炎症反应的主要参与者，可通过M1/M2型极化发挥免疫调节作用。我们认为: SHED外泌体中某些“关键miRNA”可通过下游靶基因影响MG极化相关通路，进而通过免疫调节作用治疗TBI。据此，本课题拟采用基因芯片/生物信息学分析、基于慢病毒载体抑制/过表达技术及其他分子生物学技术，首先，筛选出SHED外泌体中起关键作用的miRNA；其次，通过细胞及动物模型，验证“关键miRNA”对MG的极化调控作用及对TBI的治疗效果；进而研究其对MG极化方向的下游IL-4/IL-13等相关通路的调控机制。为SHED及其外泌体应用于TBI治疗提供一定的理论与实验依据。

人脱落乳牙牙髓干细胞（Stem cells from human exfoliated deciduous teeth ，SHED）来源于年轻牙齿，是未成熟的间充质干细胞，具有较成熟的间充质干细胞更好的活性，且取材无任何损伤，不涉及伦理学限制，已经被广泛的应用于多种组织的修复再生中。更有研究表明，SHED还能够表达神经元表面标志物，分化为神经细胞，促进神经细胞增殖，因此也被认为是潜在的修复神经损伤的细胞之一。然而，SHED修复神经损伤的效果如何，其发挥作用的途径又是什么，尚待深入研究。创伤性脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）是指由外力引起的脑组织结构及功能的损伤，引起相应损伤部位的运动或认知功能障碍。我们前期研究发现，SHED移植能够改善大鼠TBI造成的功能障碍，本研究以此为基础，聚焦于SHED发挥功能的途径。越来越多的研究表明，干细胞移植发挥作用的关键更多的依赖于旁分泌的细胞间通讯，细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）是其中重要的媒介。EV是由多种成分构成的混合物囊泡，除了包涵细胞膜特征性蛋白质和脂质外，最值得关注的是其携带的，能够通过抑制受体细胞靶基因而调节其功能的一类核酸－microRNA（miRNA）。miRNA由于其稳定性及向EV主动选择性分泌的机制，因而被认为是EV发挥有效功能的关键。我们前期研究提示，SHED分泌的EV（SHED-EV）可能通过作用于大鼠TBI损伤区域的小胶质细胞（Microglia，MG），促进损伤修复。本研究通过体内外实验，证明了SHED-EV通过调控MG的极化方向抑制神经炎症，SHED-EV中发挥关键作用的miRNA是miR-330-5p，miR-330-5p的下游靶基因是Ehmt2。miR-330-5p/Ehmt2促进H3K9me2介导的CXCL14的转录，调控小胶质细胞的极化，SHED-EV/miR-330-5p局部注射能够修复大鼠TBI造成的组织及神经功能的损伤。本研究明确了SHED-EV的神经调控作用，确定了SHED-EV中携带的关键信息及下游的信号通路，为牙源性干细胞SHED极其分泌的EV应用于TBI治疗提供一定的理论与实验依据。

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