HIF通过调节内皮唾液酸蛋白表达诱导布加综合征发生肝纤维化的机制研究

Budd-Chiari syndrome (BCS), which is characterized by hepatic venous outflow obstruction, can frequently induce the development of liver fibrosis. However, the mechanisms of BCS-related and chronic viral hepatitis-related liver fibrosis may be largely different. Hepatic stellate cell (HSC) and its specific marker endosialin play an important regulatory role in the development of liver fibrosis. Additionally, hypoxia microenvironment and hypoxia inducible factor (HIF) are involved in the regulation of endosialin. Therefore, we hypothesize that hypoxia microenvironment caused by BCS can regulate the expression of endosialin in HSC via HIF signaling pathway, and then affect the function of HSC and development of liver fibrosis. The present work will be divided into two major parts: 1) in the BCS animal model and clinical studies, the relationship between the severity of liver fibrosis and the expression of HIF and endosialin in HSC will be explored; and 2) in the in vitro cell system, the effect of hypoxic microenvironment, HIF-1α or HIF-2α on the expression of endosialin in HSC will be explored, and the effect of endosialin on the MAP kinase ERK-1/2 phosphorylation and the expression of early transcription factor c-Fos will be detected. This work will elucidate whether HIF signaling pathway regulates endosialin expression, thereby inducing the development of BCS-related liver fibrosis.

布加综合征（BCS）可导致肝纤维化，但其与慢性肝炎所致肝纤维化的分子机制可能有所不同。研究表明，肝星状细胞（HSC）及其特异性标记分子内皮唾液酸蛋白在肝纤维化的发生过程中起着重要的调节作用，而缺氧微环境和缺氧诱导因子（HIF）可能调节内皮唾液酸蛋白表达。我们推测，BCS造成缺氧微环境后，HIF信号途径调节内皮唾液酸蛋白表达，进而影响HSC功能和肝纤维化的发生。本研究包括两大部分。1）在BCS动物模型及临床患者中，检测肝脏组织中HIF表达水平、HSC激活水平及内皮唾液酸蛋白表达水平，并分析它们与肝纤维化之间的相互关系。2）在体外细胞系中，探讨缺氧微环境是否通过上游的HIF诱导HSC中内皮唾液酸蛋白表达，并分析内皮唾液酸蛋白是否通过影响下游的MAP激酶ERK-1/2磷酸化以及早期转录因子c-Fos表达以影响细胞增殖和迁移。本研究将阐明HIF通过调节内皮唾液酸蛋白的表达以影响BCS发生肝纤维化。

布加综合征（BCS）可导致肝纤维化。肝星状细胞及其特异性标记分子内皮唾液酸蛋白（CD248）在肝纤维化的发生过程中起着重要的调节作用，而缺氧微环境和缺氧诱导因子（HIF）可能调节CD248表达。本研究旨在从临床、动物模型和体外细胞系统的多个角度探讨缺氧对肝星状细胞中CD248表达的调控以影响BCS导致肝纤维化的机制。临床样本。我们获取9例确诊为BCS患者的肝脏组织标本。天狼猩红染色分析及免疫组化检测发现，虽然胶原纤维面积百分比与CD248（r=0.570，P=0.109）、HIF1α（r=0.630，P=0.069）及HIF2α（r=0.252，P=0.513）呈正相关，但并不显著；CD248与HIF1α（r=0.285，P<0.001）、HIF2α（r=0.382，P<0.001）呈显著正相关。我们选取9例人的正常肝脏标本，比BCS患者的肝脏组织标本有着显著更低的CD248（21708±17349 vs 34066±13746，P=0.005）及Desmin（1945±6748 vs 11383±20079，P=0.025）水平，但HIF1α（57610±25319 vs 65818±29068，P=0.274）及HIF2α（26211±26133 vs 37071±25997，P=0.132）水平在两组间未达到显著差异。动物模型。我们通过血管介入技术下球囊阻断肝静脉血流、注入无水酒精、填塞明胶海绵的方法成功建立肝静脉阻塞的比格犬动物模型。6个月后，病理检查提示肝脏损伤，但并未发生显著肝纤维化。分子水平。我们成功构建HIF1α及HIF2α RNAi慢病毒、HIF1α及HIF2α过表达慢病毒载体，qPCR及Western blot结果验证了RNAi组HIF1α/HIF2α表达下调，过表达组HIF1α/HIF2α表达上升。确定氯化钴浓度为1000uM作为最佳厌氧条件。成功感染lx2人肝星状细胞，qPCR结果显示RNAi组CD248表达下调，过表达组CD248表达上升。Western blot结果显示HIF1α/HIF2α RNAi/过表达组c-Fos表达改变，Raf、MEK、ERK表达无显著改变。本研究提示BCS肝纤维化程度可能与CD248表达潜在相关，且CD248表达可能受HIF1α及HIF2α调控。这为阐明BCS导致肝纤维化的机制以及研发防治手段提供参考。

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