基于质谱学和酶活性测定的酒精饮料中氨基甲酸乙酯筛查方法研究

This project aims at the new method research on mass spectrometry and enzyme activity assay of ethyl carbonate (EC) screening study, and the establishment of high sensitivity, convenient and reliable method for screening of EC in alcoholic beverages. Aiming at the EC, by-products unable to avoid in the course of the production and transportation of alcoholic beverages, the screening method based on enzymatic reactions will be established. The assistant reagent, organic medium, nano materials and the introduction of derivative reaction will be used to improving the EC inhibition of cholinesterase. The assistant reagent with hydrogen bonding ability and hydrophilic and hydrophobic properties, can change the space conformation of the region of or around of the activity area of enzyme, thus changing the way of the combination of substrate or inhibitor with the enzyme. The presence of organic medium, two-phase condition, is not only beneficial to the better rigidity of enzyme conformation, but also conducive to the cholinesterase enzyme reaction determination. Nanometer material is introduced, to a certain extent, to simulate model of enzyme in intracellular microenvironment. The derivatization reaction of EC with high yield in water/ethanol will be applied in order to improve the EC inhibition of cholinesterase. The object is to obtain the lower detection limit, high sensitive, convenient and reliable screening method for detection of EC, which will broaden the thought for detection EC in alcoholic beverages, provide technical support for rapid high throughput screening of EC and lowering the detection limit.

本课题旨在开展基于质谱学和酶活性测定的酒精饮料中氨基甲酸乙酯（EC）筛查新方法研究，建立高灵敏度、方便可靠的EC筛查方法。针对酒精饮料中生产及储运过程中无法避免产生的副产物-EC，通过辅助试剂、有机介质、纳米材料的引入和衍生化反应，以期提高EC对胆碱酯酶的抑制作用，从而建立基于酶反应的EC筛查方法。辅助试剂的氢键结合能力与亲水疏水性质可以改变酶的活性区域或者活性区域周围的空间构象，从而使底物或者抑制剂与酶靠近及结合难度和方式可能发生改变；有机介质存在下，不但有利于两性的酶可以表现出更好的刚性，而且有利于胆碱酯酶的酶反应测定；纳米材料的引入，可以在一定程度上模拟酶在细胞内的纳微环境；结合水/乙醇相中的EC高产率的衍生化反应，以期提高EC对胆碱酯酶的抑制作用，进行基于酶反应的EC筛查方法研究，为检测酒精饮料中的EC拓宽思路，为高灵敏度、方便可靠的EC筛查方法的建立奠定基础。

针对酒精饮料中生产及储运过程中无法避免产生的副产物-氨基甲酸乙酯（EC），开展了基于质谱学和酶活性测定的酒精饮料中EC筛查新方法研究。分别尝试利用人造血浆替代普通缓冲溶液来改变乙酰胆碱酯酶的存在环境和辅助试剂来改变乙酰胆碱酯酶的活性，两种方法皆能提高酶对抑制剂敏感程度，虽然不适用于酒精类饮料氨基甲酸乙酯含量的检测，但是所开发的方法可在有机农残含量的检测方面得到很好的应用。. 开发了以占吨醇作为辅助试剂，利用衍生化反应与液液萃取同时进行以达到提高EC萃取效率的目的，同时，在气相进样口高温气化的过程中衍生化产物可发生逆反应，分解得到EC，用中心切割二维气相色谱—质谱法对EC进行检测。该方法对EC检测的检出限为0.02μg/L，定量限为0.20 μg/L，线性范围为2.00μg/L-200.00μg/L，线性相关性系数达到0.9998。我们将该方法应用于杨梅酒、米酒、葡萄酒、黄酒中EC的定量检测，发现黄酒中其含量最高。本研究所建立的分析方法灵敏度高，所用试剂易得且操作简单，无需耗费大量时间及费用。该研究结果发表于Analytica Chimica Acta 2018, 1001, 86-92.. 本项目还进行了基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）同位素底物双通道酶抑制测量法（DEIM）的开发。本研究合成了新的乙酰胆碱酯酶同位素底物，实验组加入抑制剂和轻质底物，对照组加入水和重质底物，反应结束后混合，点到一个靶点上。根据谱图的峰强度可直观看出抑制剂对乙酰胆碱酯酶的抑制效应，计算抑制率，将该方法用于实际样本中抑制剂的筛查中，发现25份植物粗提物中有一半能抑制AChE的活性。实验证明，所建立的DEIM精密度高，实用性强，无需进行复杂的样本前处理，有望发展为未来的药物高通量筛选平台，并将推动新药筛选的发展。该研究结果发表于J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2018, 29, 2427-2435.. 设计开发了热辅助的碳纤维离子化装置，该装置对挥发性化合物、低（非）挥发性化合物均能实现高效率的离子化，并且对复杂样本不经前处理即可原位实时梯度分析，应用范围广，普适性强，申请国家发明专利和实用新型专利各一项。

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