中国恙虫病东方体强弱毒株mRNA转录组分析、毒力因子鉴定及致病机制研究

Recently scrub typhus widely distributed in China with more and more cases. Various strains isolated from different regions exhibited different virulence and clinical severity. The virulent strain can cause sever clinical symptom in hunman and experimental mice while the avirulent only cause light symptom.There surely be some distinct or differentiate expressed virulent factors between virulent and avirulent orientia tsutsugamushi strains.However,little is known about the genome information, virulent factor and molecular pathogenesis of Chinese Orientia tsutsugamushi strain by now. Recently developed RNA sequencing technology here was used to obtain the mRNA transcriptome profiles of the virulent and avirulent orientia tsutsugamushi strains isolated from Pingtan, Fjian and Dongtai,Jiangsu respectively ,the genetic and evolutinary laws were analyzed by bioinformatics; The specific and the differentiate expressed genes were screened by transcriptome comparison and pathogenic and virulece related genes was predicted, aiming to identify the virulent related factors and deeply understand the molecular pathogenesis of scrub typhus,and provide instruction for the designment of molecular vaccine of scrub typhus.

我国不同地域存在不同东方体株型，其型别、毒力及所致临床表现均存在明显差异。强毒株毒力强，引起病人症状典型且严重，对小白鼠致病性强；弱毒株毒力弱，病人症状较轻而不典型，小白鼠敏感性低。可以推断，强弱毒株肯定存在某些毒力因子的不同或毒力因子的表达水平不同。但目前我国不同株型东方体的基因组信息尚不明确，东方体的毒力因子及致病机制尚未阐明。本研究拟采用转录组测序（RNA-seq）技术，分别对东方体强毒株平潭株（Ptan）和东方体弱毒株东台株（Dtai）进行mRNA转录组测序，并参考国外东方体Ikeda和Boryong的基因组序列库，确定中国强弱株mRNA转录组信息，进而用生物信息学分析中国株东方体的遗传、进化规律等；通过mRNA转录谱比较筛选强弱毒株特异性及差异表达基因，生物信息学预测分析筛选致病及毒力相关基因，以期深入阐明东方体的毒力因子和致病机制, 并为恙虫病的分子疫苗的设计提供理论指导。

我国属于恙虫病重点疫区之一，疫区呈全国分布。各地恙虫病流行病学特征、病原型别、毒力均存在明显差异，但目前我国不同株型东方体的基因组信息尚不明确，东方体的毒力因子及致病机制尚未阐明。此外，恙虫病与其他热性病临床症状相似，极易引起误诊，需建立敏感、特异的快速诊断方法。本研究（1）首次利用percoll密度梯度离心分离纯化东方体，测序获得国内恙虫病强度株基因组序列，得到7，771901对序列，平均长度2150bp，总碱基数是2，331，570，300bp，鉴定出2，705个基因，为进一步诠释恙虫病致病机制提供了依据；（2）用现场流行病学、分子流行病学、分子生物学等技术，现场调查和实验室研究相结合，分别对安徽三界新疫区、福建厦门、云南中部地区和江苏省新疫区靖江恙虫病流行病学和危险因素调查，阐明了安徽三界和江苏靖江为丘陵型、福建厦门为岛屿型、云南中部为高原型疫源地，发病高峰时间安徽三界和江苏靖江为秋冬季，福建厦门和云南中部为夏季。不同区域东方体基因型别存在差别，如安徽三界至少存在Gilliam和Young-worl两种东方体基因型别，云南则以karp型为主。野营训练、捆扎和搬运干草以及居住在乡村边缘会增加疾病的发生危险率，研究结果为不同区域恙虫病有针对性的防控提供了指导意义；（3）恙虫病东方体56kD外膜蛋白既是诊断靶抗原，又是毒力候选分子，本研究将三界和合肥株东方体56kDa蛋白序列基因在原核系统克隆表达，亲和层析法纯化目的蛋白，Western-blot鉴定其免疫学活性，为进一步研制广谱诊断试剂，疫苗以及分析其在东方体致病的分子机制奠定基础。 (4)针对恙虫病东方体56kDa蛋白序列基因建立重组聚合酶扩增方法（RPA）应用于基层现场快速检测。特异性好，检测恙虫病东方体基因组DNA的灵敏度达到11.6copies/μL，与荧光定量PCR法检测的灵敏度一致。该法建立为生物恐怖袭击或疫情突发等情况的现场检测提供了一种新的快速、特异、灵敏的核酸检测方法。同时为其他立克次体以及它种病原体的RPA检测方法的建立奠定了基础。. 共发表论文4篇，其中SCI论文3篇，中文核心期刊1篇。2017年获江苏省预防医学科技进步二等奖1项。

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