海葵毒素APETx2与离子通道相互作用的结构基础及多肽药物设计

Life is originated from the ocean. As efficient biotoxins, marine peptide toxins are great gifts for human beings to overcome major diseases.Due to their relative specificity and little side effects, they obtained great market sucess. Research and discovery of new drugs based on the leading structure of toxins has gradually become a new approach in drug design.Sea anemone toxin APETx2 can simultaneously act on acid-sensing ion channels 3 (ASIC3) and voltage-sensitive sodium ion channels 1.8 (Nav1.8), both of which mediate in regulating nociception and provide new hope for designing new drugs for morphine substitution.However, little information about the relationship of structure and function as well as the nonspecific target,has hindered the new peptide drug design based on this leading structure.With a combination of multidisciplinary research approaches, including point mutations,peptide conformation analysis, patch clamp,here we intend to identify the structural basis for the interactions between APETx2 and ASIC3, Nav1.8, and in turn to use the effective peptide fragment scanning, toxin mutantion and solid phase peptide synthesis method, to find mutated toxin or fragment of this peptide specifically targeting on ASIC3 and Nav 1.8. These new modified peptides will provide effective research tools. This project will provide lead compounds and theoretical basis of new analgesic drugs for morphine substitions,via studying the analgesic effects of transformation of toxins by electrophysiological and behavioral researches.

生命起源于海洋，海洋多肽类毒素作为高效的生物毒素是海洋馈赠给人类攻克重大疾病的利器。因其靶点相对特异，毒副作用小，目前已有药物成功上市；以毒素为先导结构的新药研发逐渐成为研究热点。海葵毒素APETX2可同时作用于酸敏感离子通道（ASIC3）和电压门控钠离子通道（Nav1.8），从而调节痛觉感受，为寻找替代吗啡的全新镇痛多肽带来希望；但由于其结构与功能关系并不十分明确，作用靶标也不十分特异，这一缺陷阻碍了以其为先导的多肽药物设计。申请人拟采用点突变、构象分析、复杂体系计算、膜片钳等方法分别鉴定APETX2与ASIC3，Nav1.8相互作用的结构基础；并以此为基础，通过有效片段搜寻、毒素突变体基因工程制备与固相合成等方法，获得可分别作用于ASIC3和Nav1.8的特异毒素或片段多肽，提供有效的研究工具；并通过电生理和行为学深入研究改造毒素的镇痛作用，为进一步寻找替代吗啡的镇痛药物提供理论基础。

全世界每年用于缓解或治疗疼痛的医疗花费甚至大于传统三大健康杀手糖尿病，心血管疾病和肿瘤的总和。传统的镇痛药往往有药物耐受，成瘾，镇痛效果不佳等缺陷。寻找新的可替代吗啡的高效、无耐受成瘾的镇痛药一直是疼痛研究领域亟待解决的科学难题。.海洋多肽类毒素是海洋生物毒素中毒性最强的毒素，它们通常特异地作用于离子通道或神经受体具有广泛的药理活性如镇痛、强心、降压、抗病毒、麻醉等。APETx2是Diochot et al.从海葵(Anthopleuraelegantissima)中分离到的一种长度为42个氨基酸的多肽类毒素。研究发现，APETx2对电压门控钠通道 Nav1.8和配体门控酸通道ASIC3 这两种在疼痛信号的外周神经传导中起重要作用的离子通道都有显著的抑制作用。但是APETx2与这两种离子通道的相互作用结构基础一直未明确。本项目拟研究毒素多肽APETx2 与对应离子通道相互作用的结构基础。并以此为基础，设计表达/合成可分别特异作用于离子通道ASIC3和Nav1.8的APETx2突变体或缩短片段，为科研提供强大的分子工具。.为了获得高活性的APETx2多肽，首先我们利用分子生物学技术构建大肠杆菌融合表达系统和酵母真核表达系统，经全细胞膜片钳检测，纯化得到的重组APETx2能达到天然分离的APETx2活性的80%。产量高达 5 mg/ml。这为后续的研究奠定坚实的物质基础。.其次，我们以APETx2核磁结构为研究起点，采用长时间尺度常规分子动力学研究各个结构域的动态变化以及分子表面的电荷分布发现APETx2 β2，β3 之间的linker 与β3，β4 之间的linker形成的疏水中心可能是参与靶受体相互作用的热区。.我们进一步研究发现ASIC3分子有大量的负电荷表面，也有一些区域是正负电荷交叉分布的区域。而这个区域很有可能是APETx2 与ASIC3 相互作用的热区。与此同时，我们发现β2，β3 之间的linker 与β3，β4 之间的linker 的下端则很有可能是APETx2与Nav1.8的作用热区。进一步的分子对接和丙氨酸扫描突变结合全细胞膜片钳确认了这个结果。当前我们正在基于这个结果设计表达/合成可分别特异作用于离子通道ASIC3和Nav1.8的APETx2突变体或缩短片段，作为候选多肽药物用于后续的应用研究。

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