七鳃鳗一种新型模式识别蛋白LIP识别病原菌激活VLRB+类淋巴细胞的分子机制研究

Previous studies have shown that a novel protein LIP found in lamprey blood was capable of binding to bacterial Lipopolysaccharide (LPS) and Peptidoglycan (PGN) to induce pathogens aggregation. Meanwhile, the proliferation of VLRB+ lymphocyte-like cells was found obviously after the animals were stimulated with Escherichia coli. These clues suggested that LIP and VLRB+ lymphocyte-like cells may play important roles in the resistance of the pathogens invasion. In this project, in situ hybridization and immunohistochemistry will be used to analyze the localizations of LIP in immune associated tissues of lampreys based on the previous studies described above. LIP mediated pathogens recognition will be confirmed by using ITC analysis. The expression of VLRB+ lymphocyte-like cells is analyzed by CRISPR/Cas9 technology mediated LIP gene knockout assay. All these researches have important significance in explaining the molecular mechanism of LIP which mediates pathogens recognition and activates VLRB+ lymphocyte-like cells in lamprey. This project will provide new information on the vertebrate immune defense system, and providing valuable clues for studying the origin and evolution of human immune system.

我们在前期工作中发现七鳃鳗血液中存在一种能够识别细菌表面的脂多糖和肽聚糖并发挥凝集病原菌功能的蛋白质LIP。同时发现，七鳃鳗接受大肠杆菌刺激后VLRB+类淋巴细胞出现明显增殖现象。上述线索提示LIP和VLRB+类淋巴细胞在七鳃鳗抵御病原菌入侵过程中起到重要作用。本课题在前期研究基础上，拟以原位杂交和免疫组化法分析LIP在七鳃鳗主要组织的分布情况；采用ITC等方法确定LIP识别病原菌的方式；以CRISPR/Cas9法建立七鳃鳗LIP基因敲除动物模型研究缺失LIP基因后经病原菌刺激VLRB+类淋巴细胞的表达差异情况。最终确定七鳃鳗LIP识别病原菌，激活VLRB+类淋巴细胞的分子机制。上述研究将为完善脊椎动物免疫防御体系研究提供新思路；同时也为更好的了解人类免疫防御体系起源与演化历程提供了关键线索。

本研究以七鳃鳗重要免疫防御分子LIP为主要研究对象，系统阐明了LIP识别病原菌并激活VLRB+类淋巴细胞信号通路的分子机制。首先，本研究利用人工授精方法获得东北七鳃鳗胚胎，系统观察了七鳃鳗胚胎受精卵期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、头期、孵出前期及孵出期变化情况。搭建起七鳃鳗人工繁育平台；其次，对LIP在七鳃鳗主要组织的分布情况进行鉴定，表明LIP在七鳃鳗胚胎发育各个时期均有表达并主要分布在鳃、心、口腔腺、鳃囊、肌肉和肠纵褶；第三，对LIP的杀菌机制进行研究结果表明，LIP以多聚体的形式沉积于细菌表面并能够与细菌细胞膜表面的磷脂酰甘油、胆固醇和甘油磷脂、脂多糖结合，并在短时间内诱使细菌细胞内活性氧水平明显升高，细菌细胞膜发生去极化现象，进而对细菌细胞质膜产生破坏，最终导致细菌进入以质壁分离和内容物外泄为特征的细菌细胞坏死状态；第四，利用吗啉反义寡核苷酸技术建立七鳃鳗LIP基因沉默动物模型，结果表明沉默LIP后，七鳃鳗胚胎发育正常，在11～12天孵出幼鳗；第五，利用基因芯片技术对LIP基因沉默组与对照组相比组转录本变化情况进行分析，共筛选出4593个显著差异表达基因，参与240条信号通路，在18条代谢通路中显著富集(如肌萎缩性脊髓侧索硬化、核糖体、色氨酸代谢等)。尤其对VLRB、L-BLNK、L-NF-κB等B淋巴细胞样信号分子影响显著；第五，分别利用吗啉反义寡核苷酸技术制备七鳃鳗VLRB、L-BLNK、L-NF-κB基因沉默动物模型，并且VLRB、L-BLNK、L-NF-κB在七鳃鳗胚胎发育过程中均发挥重要最用；第六，鉴定出嗜水气单胞菌为七鳃鳗致病菌。当受到致病菌感染时，能够激活七鳃鳗体内七鳃鳗VLRB介导L-BLNK及L-NF-κB参与的（B淋巴细胞样）信号转导通路。综上，本研究系统阐述了七鳃鳗LIP识别病原菌并激活VLRB介导B淋巴细胞样信号转导分子机制。上述研究将为系统阐述脊椎动物免疫防御演化历程奠定坚实理论基础，同时也为更好的了解人类免疫防御体系起源与演化历程提供了关键线索。

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