外泌体内甲基丙二酸脑内转运研究及其在甲基丙二酸血症导致脑损伤诊断中的应用

Methylmalonic acidemia (MMA) is the most common organic acidemia in children. Many patients with MMA suffered brain injury. Methylmalonic acid is recognized as pathogenic substance of MMA. Our previous study found that subcutaneous injection of methylmalonic acid induced activation of microglia and increase of inflammatory factors and oxidation substance and apoptosis of neuron in hippocampus. It is a potential mechanism of MMA-induced brain injury. However, the intercellular and intracerebral barrier transport of methylmalonic acid is unclear. Recent studies show that exosomes mediate the transfer of information packets within intercellular communication. In this study, exosomes packaged deuterium-labelled methylmalonic acid（d3-MMAcid）are used for intervention test of brain capillary endothelial cells, choroid plexus epithelial cells, microglia and hippocampal neurons, Transwell test and animal test. The gas chromatography-mass spectrometry is used to track d3-MMAcid. It will reply the questions that whether exosomes packaged d3-MMAcid can transport intracerebral barrier, change the content and distribution of d3-MMAcid in brain tissue and induce activation of microglia and apoptosis of neuron by intercellular transfer. Clinical test will be implemented to clarify the value of methylmalonic acid derived from CSF and serum exosomes for diagnosis of MMA-induced brain injury.

甲基丙二酸血症（MMA）是儿童最常见的有机酸血症，常导致脑损伤。甲基丙二酸是公认的MMA致病物质。本课题组前期研究发现，皮下注射甲基丙二酸能引起大鼠海马部位小胶质细胞激活、炎性因子和氧化物质升高，导致神经元凋亡，这可能是MMA导致脑损伤的机制。但甲基丙二酸如何跨越脑内屏障及细胞间转运尚不明确。研究表明，外泌体可作为细胞间信息传递载体。本研究拟利用氘标记甲基丙二酸（d3-MMAcid）外泌体进行脑毛细血管内皮细胞、脉络丛上皮细胞、小胶质细胞和海马神经元干预实验，Transwell转运实验和动物实验。通过气相色谱串联质谱追踪d3-MMAcid的分布，以便解答高甲基丙二酸外泌体是否能够跨越脑内屏障，是否通过细胞间转运改变大鼠脑组织中d3-MMAcid的含量和分布以及是否与小胶质细胞激活和神经元凋亡相关等疑问。通过临床检测，明确CSF和血清外泌体内甲基丙二酸水平对MMA导致脑损伤诊断的价值。

甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，MMA）是儿童期最常见的有机酸血症。主要由于患儿甲基丙二酰辅酶A变位酶或者其辅酶维生素B12缺陷，导致甲基丙二酸在血液和组织中蓄积而致病。MMA导致脑损伤症状发生率约为60-80%，占MMA症状首位。目前认为MMA导致脑损伤的病理基础是由于甲基丙二酸在脑部蓄积造成了神经元的损失。然而，甲基丙二酸脑内转运的机制尚未明确。外泌体是一种直径30-100nm的双层膜结构，参与细胞间通讯。外泌体与甲基丙二酸脑内转运是否有关联尚未见报道，其在MMA诱发脑损伤中的作用机制也未明确。本研究通过收集对照组和MMA病例组标本进行检测，明确了血清外泌体内甲基丙二酸水平作为MMA导致脑损伤诊断标志物的价值。利用细胞实验，明确了高甲基丙二酸外泌体对脉络丛细胞和神经元细胞的生长抑制作用。利用Transwell转运实验，明确了高甲基丙二酸外泌体可以通过影响脉络丛上皮细胞的分泌而进入神经元细胞或小胶质细胞中。大鼠幼仔侧脑室注射高甲基丙二酸外泌体可引起皮质中神经元凋亡，海马小胶质细胞部分激活。大鼠幼仔尾静脉注射高甲基丙二酸外泌体可引起皮质神经元凋亡，海马和脑血管附近的小胶质细胞部分激活，脑血管紧密连接蛋白ZO-1表达降低，脑皮质氧化物质和神经炎性细胞因子升高，还原物质和酶类降低。上述结果提示：高甲基丙二酸外泌体可能是甲基丙二酸从血液至脑内或者脑组织之间转运的重要方式之一。同时，高甲基丙二酸外泌体可引发神经炎症反应、诱导神经元凋亡从而成为MMA诱发脑损伤的一个重要机制。

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