基于拟干酪乳杆菌呼吸代谢响应环境高渗应激和氧化应激分析的高浓度乳酸生产研究

Environmental hyperosmolarity and oxidative stress during the late phase have been found to be the primary limitations for efficient high lactic acid concentration production by Lactobacillus paracasei. In this study, the mechanisms of cell responses to environmental stresses with respiratory metabolism in L. paracasei will be investigated through integrated genetic, cellular and macrodynamic analyses. And then, a cost-effective, technically feasible process strategy will be developed for high lactic acid concentration production. Firstly, the physiological parameter, oxygen uptake rate, is adopted to characterize cell respiratory level, and the kinetics of cell growth and metabolism under environmental hyperosmolarity and oxidative stress are determined. Subsequently, through the metabolome technology, intracellular metabolomic profiling can be obtained to explore characteristic or universal biomarkers under these two stress conditions. Finally, with the physiological function verification of the biomarkers by integrating the analyses of characteristic gene transcription, key enzyme activity and 13C intracellular metabolic flux, the mechanism of cell respiration responding to environmental hyperosmolarity and oxidative stress as well as their cross-over responses will be further unraveled. This also lay the foundation for the development of efficient and stable process strategy in high lactic acid concentration production.

拟干酪乳杆菌生产高浓度乳酸过程中，发酵后期细胞受到的高强度渗透应激和氧化应激是限制整体发酵效率的主要因素。本课题将以潜在工业生产菌拟干酪乳杆菌为研究对象，从分子、细胞和宏观动力学水平，解析细胞呼吸模式下响应环境高渗应激和氧化应激的作用机理，并在此基础上指导高效稳定、技术可行的高浓度乳酸发酵过程控制策略的开发。首先，通过生理参数氧摄取速率来表征呼吸强度，获得呼吸模式下细胞对环境高渗应激和氧化应激的生长和代谢动力学。其次，应用代谢物组学技术，得到细胞响应两种环境应激的胞内代谢物组图谱，并利用统计学方法找到特征标代谢标志物和共性代谢标志物。最后，结合应激特征基因的转录表达分析、细胞代谢途径关键酶活性分析以及13C胞内代谢通量分析，验证这些标志物的生理作用，并阐明细胞呼吸模式下响应两种环境应激以及交互作用的机理，进一步指导高效生产的高浓度乳酸发酵工艺的开发。

随着环境保护意识的加强，全球对于聚乳酸材料的需求大大增加，这也促进了对于乳酸单体的需求。在乳酸菌发酵生产高浓度乳酸过程中，发酵后期细胞受到严重的环境高渗应激和氧化应激的租用，从而极大地限制了乳酸的生产效率。本研究以潜在工业乳酸生产菌拟干酪乳杆菌为研究对象，通过对比发酵和呼吸模式下细胞宏观代谢特性，发现0.5 mmoL/L/h的呼吸强度能够很好地用于乳酸合成。而且在呼吸模式下，细胞能够比发酵模式条件更好地响应环境高渗应激和氧化应激。利用代谢物组、代谢通量、关键酶活、关键基因转录等分析技术，从分子、细胞和环境水平解析拟干酪乳杆菌细胞在发酵模式和呼吸模式下，响应不同环境应激时的代谢机制。呼吸模式通过sod基因的高表达以及完整电子传递链的存在有助于细胞消除环境应激带来的ROS积累，从而不影响EMP途径中关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性，从而保证相对正常细胞代谢的回复。基于此，我们开发了两阶段代谢模式组合的控制策略，在不影响L-乳酸转化率的前提下，发酵时间缩短了6 h，而且使得高浓度乳酸发酵的生产速率提高19.8%。此外，针对工业规模聚乳酸级单体生产的要求，我们利用Crispr-cas9和实验室进化技术，筛选获得了一株能够高效生产高质量L-乳酸的高性能生产菌株，其能够在45℃条件下进行乳酸高效生产，且L-乳酸的光学纯度和化学纯度均达到99%以上。本项目开发的过程控制策略以及获得的高性能菌株均有很大潜力应用于工业规模高浓度乳酸发酵过程，从而显著提升生产效率。

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