基于多因子复合导电丝膜的神经轴突导向生长及其延伸中的协同作用机理

How the conductive neural regeneration materials improving the directional-growth of neuraxon has remained a challenge. In this project, the conductive poly(glutamic acid)-doped polypyrole layer can be formed on the surface of the composite fibers of poly(latic acid) and collagen via in-situ polymerization. Then neural growth factor (NGF) and axon guidance factor (Netrin3) with positive charges would be conjugated onto PGlu chains through peptide condensation technique, on which then the spermine with negative charges and GSK-3β enzyme/RHo-GTP protein with positive charges could be assemblied by layer-by-layer technique,respectively. Furthermore, four proteins-release from the assemblied composite films will controlled by micro-electrical field. Through co-culture of neural cells (PC12 or rat hippocampal cells) with the composite film, the effects of their assemblied structure, electrically-conducting, micro electrical field on the guidance growth of neuraxon and the coordinated process of neural directional elongation will be systematically studied via the combination techniche of AFM and automated cell patch-clamp. Finally, a digital model of the multiariable relation between the composite neural material and axon elongation could be fibricated through a simulation technology, and coordinated mechanism of this material improving the axon elongation will be proposed.

导电性神经修复材料如何促进神经轴突的生长是当前的挑战之一。本项目首先用位聚合技术在聚乳酸-胶原复合平行丝表面包覆聚谷氨酸(PGlu)掺杂的聚吡咯(PPy)导电层；再采用多肽缩合技术在PGlu分子链上结合神经生长因子(NGF)、神经导向因子(Netrin3)而使之带正电荷；然后用层-层包覆(LBL)技术在其表面分别静电组装上精胺(负电荷)和GSK-3β酶、Rho-GTP蛋白(正电荷)，并在微电场作用下研究其结合四种蛋白的控制释放。将其与PC12或大鼠神经海马等细胞共培养，并将用全自动细胞膜片钳与原子力显微技术结合，系统地研究这种复合丝层的组装结构、电导性、微电场作用等因素对神经轴突的导向生长的影响，以及这些因素对轴突延伸的协同作用过程。最后用数字仿真技术构建这种复合材料与神经轴突延伸的多元相关数学模型，提出其促进神经轴突生长的协同作用机理。这将为开发临床用神经损伤修复材料打下理论基础。

导电性神经修复材料如何促进神经轴突的生长是当前的挑战之一。. 1）本项目中，首先通过化学氧化或电化学沉积在位聚合技术在直径约为600 nm的电纺平行丝膜表面包覆一层厚约200 nm的聚谷氨酸掺杂的聚吡咯壳层；再采用碳二亚胺法在PPy-PLLA无规复合丝膜上的NGF连接量可达216 ng/cm2。然后通过多肽缩合技术把NGF和NT-3神经因子化学连接在电化学沉积的聚吡咯纳米层表面上，NGF和NT-3因子的连接量分别为458 ng/cm2 和415 ng/cm2。在恒电流0.5 mA电刺激90 min下，PC 12细胞的神经分化率很高，长出轴突的平均长度最大(达175微米)。说明本项目成功制作出了具有神经活性、可促进轴突生长的神经因子结合导电复合材料。. 2）本项目首次发现了电刺激与导电平行丝膜微结构相结合能引导神经轴突沿丝轴方向进行定向生长。在PPy-PLLA复合平行丝膜上，恒电压200 mV/cm电刺激2h/天(共计两天)的条件下，可获得149um的最长神经轴突(高于未电刺激组的114微米)和83%的轴突沿丝轴方向取向率(高于未电刺激组的68%)。. 3）电化学沉积制备了直径约为1.24微米的导电多孔平行丝膜，其表面电导率约为50 mS/cm；再采用L929细胞培养并消融技术制备了包括纤连蛋白、胶原、层连蛋白等多种胞外基质蛋白连接的PPy-PLLA导电复合丝膜，在其表面培养的PC12细胞轴突长度比未连接胞外基质蛋白的材料增加了200%（从25微米增加到175微米）；并构建多种胞外基质蛋白在导电丝膜上的结合模型，阐述了多因素促进神经轴突定向生长的协同作用机理。初步的动物实验结果表明，用这种PPy-PLLA平行复合丝膜制作的神经组织导管对大鼠坐骨神经1 cm的损伤(术后49天)具有良好的修复作用。这些研究结果对于构建可临床应用的神经组织修复导管材料具有理论和实用意义。.

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