基于光镊辅助荧光成像和发光限域型808nm激发上转换FRET纳米探针标记的单细胞分析方法研究

Single-cell analysis, due to its critical role in exploring the essence and law of vital activities, has been a hot issue for life science research. This project makes a double breakthrough in the traditional fluorescence imaging technology and develops a stable, accurate and nondestructive imaging method for sensitively detecting a single suspended cell in liquid environment. For the fluorescence imaging technology, we can simultaneously realize the optical trapping of a single cell and capture the corresponding real-time high-resolution fluorescence image by combining optical tweezers with confocal scanning imaging. For the selection of fluorescent labeling materials and the signal acquisition means, we construct a luminescence confined 808 nm-light-excited nanoprobe possessing low thermal effect and favourable FRET efficiency to tag the targets at the single cell level with high sensitivity and specificity by taking the advantages of the special anti-Stokes luminescence effect and the excellent optical properties of upconversion nanoparticles. With the assistance of these basics, the project takes intracellular Ca2+ and TK1 mRNA as the target detection models to establish an effective and practical in-situ single-cell analysis method, providing a new approach for single-cell research field.

单细胞分析对于探究生命活动的本质与规律具有重要意义，是目前生命科学研究的热点。本项目在传统的荧光成像分析技术上进行双重突破，发展了一种可在液相环境中对单个悬浮细胞进行稳定、精准、无损的高灵敏成像检测方法。在荧光成像技术上，将光镊技术和共聚焦扫描成像技术相结合，可同时实现单个细胞的光学捕获和实时高分辨荧光图像的采集。在荧光标记材料的选择与信号采集方式上，借助上转换纳米颗粒独特的反斯托克发光效应和优异的光学性质，构建了一种具备低热效应并可触发高效FRET过程的发光限域型808 nm激发纳米探针，可实现对单细胞内目标分析物的高灵敏和特异性标记。在此基础上，本项目以细胞内的Ca2+和TK1 mRNA为目标检测模型，建立了一种有效且适用的单细胞原位分析技术，可为单细胞研究领域提供新的分析方法。

细胞作为生物体结构和功能的基本单位，是了解生命过程的基础研究对象。由于单个细胞内的物质组成含量很低，目前常用的细胞组分分析技术大多还是测定细胞群体的一个稳态平均结果，因此单细胞分析对于探究生命活动的本质与规律具有重要意义。本项目在传统的荧光成像分析技术上进行突破，发展了一种可在液相环境中对单个悬浮细胞进行稳定、精准、无损的高灵敏成像检测方法。主要研究内容和结果如下：（1）在荧光成像技术上，自主搭建了一套单光束梯度力光镊和上转换发光共聚焦扫描成像相结合的分析装置，有效避免了流体粘滞力对悬浮细胞的干扰，可对单个悬浮细胞进行稳定的光学捕获，并原位实时采集细胞的高分辨荧光图像；（2）在荧光标记材料的选择上，借助上转换纳米颗粒独特的反斯托克发光和优异的光学性质，设计并合成了“三明治”结构可实现高效FRET效应的808 nm激发上转换纳米颗粒，并在此基础上进一步构建了各种新颖的传感策略，最终用于细胞内生物分子的高灵敏特异性检测；（3）以Ca2+和TK1 mRNA为两个模型目标物，将上述方法应用于被光镊捕获的单个活悬浮细胞生理过程中目标物含量的实时原位监测。本方法不仅在胞外表现出了良好的检测灵敏度和特异性，还能成为一种高效且适用的单细胞分析技术，可为单细胞研究领域提供全新的分析平台。本项目在仪器装置搭建、荧光纳米材料合成、生物传感检测以及单细胞成像分析方面完成了既定研究目标，相关研究成果以第一作者及通讯作者发表于ACS Nano、Analytical Chemistry、Chemical Communications、ACS Sensors、ACS Applied Materials & Interfaces、Biosensors and Bioelectronics等学术期刊上，申请国家发明专利一项。项目执行期间，负责人入选湖北省“楚天学子”人才计划，高质量地培养了5名硕士研究生（其中2名已毕业）。

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