bphX基因提高Cupriavidus basilensis中联苯双加氧酶催化效率的分子机制研究

The proteins encoded by the bph operon constitute catabolic pathways for various refractory pollutants, such as polybrominated diphenyl ethers (PBDE). The biphenyl 2,3-dioxygenase (BPDO) encoded by bphA1, bphA2, bphA3, and bphA4 genes plays a key role in this catabolic pathway. Among the bph operons obtained from different bacteria, the bphX and bphA1–A4 genes are closely related in spatial position, however, the function of bphX has not yet been explained. We use a self-separated high-efficiency PBDE-degrading bacteria Cupriavidus basilensis WS in our study. Our previous studies confirmed that the bphX gene can enhance the catalytic efficiency of BPDO; therefore, we will study the properties and functions of bphX with a combination of methods involving genetics, molecular biology, and bioinformatics. We will confirm that bphX is an intracellular membrane protein. Next, the molecular mechanism of bphX involved in the improvement of the catalytic efficiency of BPDO will be elucidated. This will further improve the understanding of the structure and function of bph operons. Our results will explain the role of the bphX gene in the degradation process of PBDE and its significance in the evolution of bph operons. This would contribute to the modification and development of relevant degradation pathways in the future.

bph操纵子编码的蛋白构成了多溴二苯醚等多种难降解污染物的降解代谢途径，而其中起到关键作用的是bphA1、bphA2、bphA3和bphA4等基因编码的联苯2,3-双加氧酶（BPDO）。在不同细菌的bph操纵子中，bphX基因和bphA1-A4等基因在空间位置上存在极其紧密的关联，然而对bphX的功能却一直无法解释。本项目以自主分离的高效多溴二苯醚降解菌Cupriavidus basilensis WS为研究对象，在前期已证实其bphX基因可强化BPDO催化效率的基础上，结合遗传学、分子生物学、生物信息学等手段，对BphX的性质及功能展开研究，证实BphX为细胞内膜蛋白，阐明BphX强化BPDO催化效率的分子机制，进一步完善对bph操纵子结构、功能的理解。本项目研究成果有望明确bphX基因在多溴二苯醚降解过程中扮演的角色及其在bph操纵子进化中的重要意义，有助于相关降解途径的改造和开发。

细菌的bph操纵子一般包含12个基因，协同完成联苯、二苯醚及其衍生物的降解。在bph操纵子的基因中，除bphX功能均已得到解析。而bphX在底物降解过程中发挥了什么作用至今仍不清楚。本项目对C. basilensis的bphX基因在联苯及二苯醚降解过程中的功能进行了研究。我们首先针对C. basilensis开发了高效的基于sacB的基因编辑系统。通过合成启动子Pdual，我们实现了sacB的优化表达，降低了基因编辑中蔗糖的使用。通过整合Lambda噬菌体的Red重组系统，我们有效抑制了sacB突变引起的反向筛选时的逃逸现象。最后获得的编辑工具pISacRed，可以高效实现C. basilensis的基因组编辑。利用pISacRed，我们构建了C. basilensis的bphX基因的框内敲除株。在以联苯或二苯醚为唯一碳源的无机盐培养基中，我们证实了bphX敲除可以显著降低底物的降解速率。通过对基因组的bphX和bphA2分别添加HA和FLAG标签，我们实行了免疫共沉淀，并通过western-blotting检测证实了BphX和BphA2存在互作。由于BphA2和BPDO其他组分紧密结合，故BphX和BPDO是存在互作的。最后我们引入了基于可解释AI的方法，采用XGBoost和SHAP对Fe2+、Cu2+、Zn2+浓度和BPDO介导的联苯降解能力的关联进行了分析。通过正交设计，我们获得了一系列在不同Fe2+、Cu2+、Zn2+浓度下，野生型和bphX敲除株的联苯降解率。以XGBoost模拟了金属离子浓度和联苯降解率的关系后，我们用SHAP解析了各金属离子浓度变量对XGBoost决策的影响，发现了bphX敲除可以改变BPDO介导的联苯降解对Fe2+、Cu2+、Zn2+三种金属离子的依赖性。

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