HIF-1α-MSC外泌体调控Treg/Th17平衡诱导VCA免疫耐受的作用及其机制研究

The immune tolerance induction of vascularized composite allotransplantation (VCA) is unresolved in current clinical work. There studies suggested that HIF-1α could influence the balance of Treg/Th17 has played a vital role in immune tolerance. Our Pre-Experiment discovered that MSC harbor the potential of regulating immunity. However, whether the exosomes from HIF-1α highly expressed MSC can induce tolerance remain unclear. There are studies show that HIF-1α expression could up-regulate the immune regulation ability of MSC, and function of exosome is closely related to the products of MSC. Thus, we hypothesize exosomes secreted by MSC with HIF-1α modification are even more potent in immune tolerance induction. The mechanism could be that HIF-1α could influence Treg/Th17 ratio via regulating Foxp3, RORγt expression. Our study is designed to produce exosomes from HIF-1α highly expressed MSC via gene recombination and knockout technique, and to construct VCA model through super mirco-technology, so as to investigate the relativity among Foxp3, RORγt expression and Treg/Th17 ratio, which would provide the underlying immune induction mechanism of exosomes secreted by MSC with HIF-1α and further shine light upon development of a novel strategy of inducing VCA tolerance in clinical work.

如何有效诱导VCA免疫耐受是目前临床亟待解决的难题。研究表明HIF-1α可通过影响Treg/Th17平衡进行免疫调节。课题组前期研究发现MSC外泌体具有诱导免疫耐受的作用。然而过表达HIF-1α的MSC外泌体能否更有效的诱导VCA免疫耐受尚不明确。研究证实过表达HIF-1α的MSC可提高其免疫调节作用，而外泌体的功能与其母细胞的表达产物密切相关；据此推测，过表达HIF-1α的MSC外泌体能更有效的诱导VCA免疫耐受，其机制可能为HIF-1α调控FoxP3、 RORγt的表达从而影响Treg/Th17平衡。本研究拟采用基因重组技术构建过表达HIF-1α的MSC外泌体，利用超级显微外科技术建立VCA模型，探究其与FoxP3、 RORγt表达水平及Treg/Th17平衡的相关性，旨在阐明过表达HIF-1α的MSC外泌体诱导VCA免疫耐受的作用与分子机制，为临床诱导VCA免疫耐受提供一种新的策略。

间充质干细胞 (MSC) 可以分泌外泌体来维持动态和稳态的微环境。通过携带来自供体细胞的信息，外泌体在细胞之间传递信息并调节各种生理活动。近年来，LPS预处理的MSCs（LPS pre-MSCs）被证明可以抑制炎症和提高免疫功能。炎症引发免疫排斥，许多研究表明控制炎症有利于免疫耐受。本研究评估了 LPS 预处理的 MSC 衍生外泌体（LPS pre-Exos）对炎症和移植物存活的治疗效果和机制。我们使用连续超速离心从 LPS 预处理的 MSC 上清液中分离外泌体。在体内，我们建立了将 BALB/c 躯干皮肤移植到 C57BL/6 小鼠体内的同种异体移植模型，并在注射雷帕霉素后通过尾静脉注射 LPS pre-Exos。观察和评估了 LPS pre-Exos 对移植物存活的影响。通过免疫组织化学检查巨噬细胞的积累和极化。通过流式细胞术检查脾脏中巨噬细胞的分化。在体外，将骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM) 用 LPS (100 ng/ml) 培养 6小时以建立炎症模型，并用 LPS pre-Exos 处理 24 小时或 48 小时。使用蛋白质印迹法确定了负责调节炎症的分子信号通路。通过ELISA测定炎性细胞因子的表达。通过流式细胞术评估巨噬细胞的极化。与未经处理的 MSC 衍生外泌体 (BM-Exos) 相比，LPS pre-Exos 可以更好地消除炎症。这些因子通过负反馈机制抑制炎症因子的表达。在体内，LPS pre-Exos 显着减弱了炎症浸润，从而提高了同种异体皮肤移植物的存活率。 BMDM 的流式细胞术分析表明，LPS pre-Exos 在炎症期间有助于巨噬细胞极化和调节免疫稳态。进一步研究表明，NF-κB/NLRP3/procaspase-1/IL-1β 信号通路在 LPS pre-Exo 介导的巨噬细胞极化调节中起关键作用。抑制 BMDM 中的 NF-κB 可消除 LPS 诱导的炎症通路激活和 M1 巨噬细胞极化，同时增加 M2 细胞的比例。LPS pre-Exos 可以改变巨噬细胞的极化并增强炎症的消退。这些外泌体在延长移植物存活方面具有提高的免疫治疗潜力。

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