云南砖红绒盖牛肝菌试管子实体原基发生的遗传机制

As a representative of “Yunnan fungi” which was the second only to the “Yunnan tobacco”, Boletaceae has been listed as key development industry in "twelfth five-year" plan in Yunnan province because it has been Yunnan bulk trade fungi and become a big special export and foreign exchange earning agricultural products . Due to Porcini mostly belonging to ectotrophic mycorrhiza fungi, symbiosis with plants and the research of mechanism on fruiting body growing being weak, so it is difficult to culture artificially at present. Porcini natural production has seriously declined and is difficult to sustainable use for it being influenced by enlargement market demand, the destructive picking methods and drought etc. factors. Because of the mycelial of Mycorrhizal fungi such as Porcini etc. growing slow and being unable to differentiate fruiting body under pure culture, its basic research progress has been slow. In this project, on the basis of having innovatively built the induction and cultivation system of test tube fruiting body primordial of Porcini, and using Xerocomus spadiceus as research object, we will observe cellular structure characteristics in the process of test tube fruit body primordia induced, analyze that specific gene involed in regulating the fruit body primordia express under different space and time using microtechnic,transcriptomic and Real time PCR technologies, and than preliminarily reveal the mechanism of cytology and gene expression while test tube fruiting body primordi occurring. The study above will fill up, rich and perfect scientific theory of artificial cultivation of porcini and other rare mycorrhizal edible fungi, and provide a new direction or idea for artificial breeding and controlling fruit body development to use genetic engineering in the future.

牛肝菌为云南大宗贸易真菌，以其为代表的“云菌”已成为仅次于“云烟”的一大特殊出口创汇农产品，被列为云南省“十二五”规划重点发展产业。牛肝菌大多为外生菌根菌，与植物共生，因其子实体发生机制研究薄弱，目前尚难以人工培养。受市场需求增大、破坏性采集方式及干旱等因素影响，牛肝菌自然产量已严重下降，难以持续性利用。牛肝菌等菌根菌因纯培养下菌丝生长慢、无法分化子实体，基础研究进展缓慢。本项目拟在已创新性建立牛肝菌试管子实体原基诱发培养体系的基础上，以砖红绒盖牛肝菌为研究对象，通过显微技术、转录组技术和Real time PCR技术，观察试管子实体原基形成过程中的细胞结构特征，分析参与调控子实体原基形成的特异基因的时空表达情况，初步揭示试管子实体原基发生的细胞学及基因表达机制。该研究为填补、丰富及完善牛肝菌等珍稀菌根食用菌人工培养的科学理论，为今后人工育种及利用基因工程调控子实体发育等提供新方向或思路。

牛肝菌绝大多数种(>98%)为与植物共生的外共生菌根菌。虽然牛肝菌的研究已近100年，目前仍然不能进行实验室或商业条件下的人工培养。近年来受市场需求增大、破坏性采集方式及干旱等因素影响，牛肝菌自然产量已严重下降，资源稀缺，难以实现持续性利用。在自然条件下牛肝菌的菌丝体、原基的生长发育隐藏于地下，地面的子实体期极其短暂；在纯培养条件下离开了共生植物，其菌丝生长极其缓慢、无法分化发育成原基，不能完成生命周期。这些因素阻碍了牛肝菌子实体发育机制等的基础研究。本项目拟在已创新性建立牛肝菌试管子实体原基诱发培养体系的基础上，以砖红绒盖牛肝菌(现被命名为兰茂牛肝菌)为研究对象，通过显微技术、转录组技术、Real time PCR技术及基因敲除技术，对纯培养条件下砖红牛肝菌试管子实体原基发生的细胞形态学及基因分子机制进行了研究，取得了以下重要的创新性研究成果：.1)完成了纯培养条件下生活史研究。外生菌根菌的组织培养菌丝难以发育成原基；砖红绒盖牛肝菌的担孢子于纯培养条件下也难以萌发。本项目经过反复摸索，突破了以上两个方面的技术难点，观察到了孢子萌发及原基分化时的细胞核变化情况，完成了生活史的研究。外生菌根菌的生活史研究几乎很少有成功的报道。.2)分析了调控原基及子实体形成的大量基因。通过不同发育时期15个样品的转录组测序，序列组装后共获得35,575条Unigene，对Unigene进行了基因结构分析，利用NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库进行了功能注释；通过菌丝体Vs原基，菌丝体Vs子实体，原基Vs子实体基因集合的多重比较，分析到大量原基期、子实体期的上调表达基因；利用GO、COG、KOG、KEGG数据库对能注释到的基因及其编码产物的功能属性进行了系统分析。.3)完成了真菌凝集素基因功能的研究。首先筛选在原基期上调表达的真菌凝集素基因、疏水蛋白基因，进行了不同发育时期的实时PCR验证；构建了凝集素基因xs-lectin 的RNAi敲除载体，建立了转化子的筛选和验证体系，验证了xs-lectin 在原基形成、发育过程中的重要调控作用。.综上，项目完成了预期的研究内容，达到了预定的研究目标，取得了预期的研究成果。该研究为填补、丰富及完善牛肝菌等珍稀外生菌根食用菌人工培养的科学理论，为今后进行人工育种及利用基因工程调控子实体发育等奠定了重要基础。

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