基质金属蛋白酶-7的近红外荧光探针的设计、合成及其应用

In recent, small molecule probes of protein have been emerged as a new profiling bench to trail a specific enzyme based on the activity-directed fragments with highly selective binding to the active site of the target protein, which has been widely applied in various fields including biology, pharmacology, physiology and pathology. Matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) has been verified as one of proteins with small molecular weights (19 kDa) secreted by tumor cells. It functions as a key factor to regulate the tumor cell proliferation, invasion and metastasis, and over-expression of MMP-7 is thus generally observed in various cancers such as colon and gastric cancer. Being one important biomarker of tumor, MMP-7 need to be specifically labeled to comprehend the distribution and levels of the protein in matrix, which can provide helpful information in cancer screening, early detection and early treatment. Due to the lacking of both specific peptide substrate and selective inhibitors of MMP-7, it results in the absence of the MMP-7 specific probes..Our original studies on the selective inhibitors against MMP-7 have disclosed the relationship between the structures of side chains and the selective inhibition of the enzyme. We hope to utilize the found SAR to develop the specific MMP-7 probe tethered with a near-infrared fluorescence (NIF) group as reporter and investigate the feasibilities of the screened AP in NIF-labeling of MMP-7 in serum samples, which could be further applied in cancer therapies.

开发特定蛋白质的小分子探针是近期发展起来的标记功能靶蛋白、研究蛋白质行为的新技术平台，在生物学、药学、生理学和病理学领域有着广泛的应用。基质金属蛋白酶-7（MMP-7）是由肿瘤细胞大量表达的一类小分子型分泌蛋白，是一种重要的肿瘤相关的生物标记物。利用特异性的MMP-7的小分子探针，了解其在体内基质中的分布水平，在肿瘤的筛查、早期发现、早期治疗等方面具有重要的意义。由于专一性肽底物和选择性抑制剂的缺乏，使得MMP-7的探针凸显空白。本课题基于前期对MMP-7选择性抑制剂的研究，在具有选择性结合的结构片段的基础上，利用侧链结构与选择性的构效关系，对化合物的侧链的合理优化，设计MMP-7活性导向的结构片段，引进近红外荧光报告基团，开发具有实用前景的MMP-7的近红外荧光探针分子，提供血清中MMP-7的特异性NIF标记方法，为肿瘤的筛查、早期发现、早期治疗等提供新的检测手段。

本研究首先合成了系列的基质金属蛋白酶-7（MMP-7）抑制剂，首先进一步探讨了抑制剂侧链结构、锌离子结合基团（ZBG）对催化锌离子结合能力与抑制剂对MMP-7的抑制能力和选择性之间的构效关系。研究结果表明，在保持ZBG不变的情况下，优选的抑制剂侧链P1′、P2′和P3′分别对应于L-异丁基、L-叔丁基和L-3,4-二甲氧基苯甲基。在保持侧链结构相同时，ZBG对锌离子的结合能力越强，抑制剂对MMP-7的抑制能力越强，但是会导致选择性的大幅下降。另一方面，以硝基作为ZBG，在抑制剂骨架上引入二氮杂环丙啶作为光交联基团，开发了一个具有高度选择性的MMP-7抑制剂C2。动力学结果表明，通过光辐照后，抑制剂能够与MMP-7形成共价复合物。本课题进而在C2结构的P3′侧链上引入了Cy5.5近红外荧光基团（NIF），并研究了该化合物对MMP-7的抑制能力、选择性和标记能力。结果表明，该化合物对MMP-7的抑制能力和选择性均不理想，而且光稳定性较差。. 因为硅杂派罗宁的量子产率高，水溶性好，且具有较好的光稳定性，因此，课题组开展了以硅杂派罗宁为NIF的MMP-7特异性标记的研究。为此，首先发展了一种制备9-胺基派罗宁衍生物的合成方法，该方法操作简单、收率理想，适用在对抑制剂骨架上方便地引入派罗宁荧光标签。在此基础上，课题组合成了2个相应的MMP-7特异性荧光探针（FLB-1和-2）。结果表明，以FLB-2为光活化标记物作用时，MMP-7、MMP-1和MMP-2的的IC50值分别为25 nM、57 μM和 41 μM。FLB-2标记后的MMP-7在670nm有明显的NIF发射。虽然是实际血清样品的测试中，FLB-2的检测限尚需提高，但是基本达成了本课题的研究目标。. 本项目执行期间，发表SCI论文4篇，中文核心期刊论文1篇；申请发明专利4项，其中，授权发明专利1项；培养了3名硕士毕业生。

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