乳酸菌表达载体的构建及其在黏膜疫苗传递中的应用

乳酸菌的许多种群对人和动物安全，可以直接服用，能够调节胃肠道微生态平衡，被公认为食品安全级微生物；此外乳酸菌还可以经胃肠道黏膜系统诱导机体的免疫保护效应，因而在乳酸菌细胞中表达外源抗原成为新型疫苗递送系统研究的热点。本项目将在前期研究的基础上，阐明新发现乳酸菌质粒的生物学功能，充实乳酸菌分子遗传学机制的基础理论；另外本项目还将以该质粒为骨架，构建乳酸菌表达型质粒载体，建立乳酸菌品种改良和开发应用的基因工程平台，并利用此表达型质粒载体在乳酸菌细胞中表达抗幽门螺杆菌的融合肽抗原CtUBE，通过动物免疫实验对新建立的乳酸菌表达体系作为疫苗递送系统的可行性进行分析，为研发乳酸菌活菌疫苗提供理论和实验依据。

乳酸菌是公认的食品安全级微生物，利用乳酸菌可以经胃肠道黏膜系统诱导机体的免疫保护效应，因而在乳酸菌细胞中表达外源抗原成为新型疫苗递送系统研究的热点。本研究通过不同来源收集到不同种类食用发酵酸菜17种，通过平板涂布和划线的方法分离出多种产酸细菌，质粒抽提和纸层析分析筛选出一株含合适质粒（8.7kb）的戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus），该戊糖乳杆菌对卡那霉素、利福平、红霉素、青霉素、氯霉素、四环素等抗生素敏感，而对氨苄青霉素、庆大霉素、万古霉素和多粘菌素表现出抗性。对该菌株用高温-吖啶橙法和SDS-变温法进行质粒消除试验，结果显示两种不同的质粒去除方法都可有效消除戊糖乳杆菌细胞内的质粒。质粒测序结果表明该质粒为一未见报道的新质粒，我们将其命名为pP5371。利用核酸序列分析软件对pP5371全序列进行分析，初步预测质粒的功能区和酶切位点，利用改造后的pUC19载体pUC- lac-Kan作为功能检测载体，通过实验验证预测的pP5371质粒功能区序列。以pP5371和pUC- lac-Kan为基础构建乳酸菌质粒表达载体pPZ5371，该表达载体保留了pPZ5371和pUC19的复制子序列，拥有乳酸细菌和大肠杆菌细胞的转录表达系统，可以实现在大肠杆菌和乳杆菌细胞中的扩增及表达外源蛋白，同时不含有抗生素抗性筛选标记，符合食品级表达载体的要求。将幽门螺杆菌抗原融合肽CtUBE编码序列重组到pPZ5371质粒载体，转化无质粒戊糖乳杆菌，阳性转化子用于鲜奶发酵，获得酸奶产品中未检测出融合肽CtUBE的表达，动物实验也没有明显的预防和治疗效果，这些结果表明乳酸菌质粒表达载体pPZ5371尚不适合用于黏膜疫苗的传递，不能很好表达外源蛋白可能与表达载体和外源蛋白基因序列有关。在今后深入研究中我们将选择不同的启动子、终止子、信号肽基因及外源基因序列进行筛选、组合和优化，同时分析不同长度的启动子、终止子、信号肽基因与蛋白表达的关系，力争找出最优化的组合。

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