梅山猪胚胎附植调控中Eph-Ephrin A1的功能和信号通路分析

Embryo death during embryo implantation period is an important reason causing litter size decline in pigs. Recently, it's unclear of complete regulation mechanism about embryo implantation in animals. Applicant for this project have found that Eph-Ephrin system play an important role in regulation of swine embryo implantation, and speculate Eph A1(receptor)-Ephrin A1(ligand) is the key gene playing regulation. Using fluorescence in situ hybridization technology, the study would explore expression intensity changes of Eph-Ephrin A1 gene and number changes of endometrial epithelial cell and trophoblast cell, analyze whether the changes will influence embyo migration and adhesion to endometrium. Afterwards, the study would silence expression of Eph A1 and Ephrin A1 using RNAi technology, and analyze whether cell migration and adhesion will be influenced between epithelial cell and trophoblast cell in pigs. Finally, differentially expressed proteins will be analyzed before and after gene silencing by antibody chip technology, and identify upsteam and downsteam proteins of Eph-Ephrin signaling pathway. These findings have great significance to reveal signaling pathway of embryo implantation regulation in animals and further resolve high-yield mechanism of Meishan pig.

胚胎附植时期的胚胎死亡是导致猪产仔数下降的一个重要原因，目前动物胚胎附植的完整调控机制尚不明确。项目申请者前期发现Eph-Ephrin系统在猪胚胎附植调控中发挥着重要作用，并推测Eph A1(受体)-Ephrin A1(配体)为此系统中的关键调控基因。本研究拟利用荧光原位杂交技术，探索胚胎附植前、中、后期梅山猪子宫内膜和胚胎中Eph-Ephrin A1的表达量与子宫内膜上皮细胞、胚胎滋养层细胞数量的变化规律，分析这种变化是否影响胚胎的迁移和与子宫内膜的粘附过程；然后利用 RNAi技术，沉默Eph A1和Ephrin A1基因的表达，分析猪上皮细胞和滋养层细胞之间的迁移和粘附能力是否受到影响；最后用抗体芯片技术分析基因沉默前后细胞中的差异表达蛋白，鉴定出Eph-Ephrin 信号通路的上、下游蛋白。其研究结果对揭示动物胚胎附植调控的信号通路和进一步解析梅山猪高产仔机理具有重要意义。

(项目背景)胚胎附植时期的胚胎死亡是导致猪产仔数下降的一个重要原因，目前猪胚胎附植的完整调控机制尚不明确。项目申请者在前期研究基础上，开展了Eph-Ephrin家族成员和瘦素受体对猪胚胎附植调控的影响研究。另外，针对中国本地品种猪脂肪含量过高的现象，申请者还开展了瘦素受体(LEPR)、脂肪基因(FTO)和脂蛋白脂肪酶(LPL)对苏钟猪脂肪沉积的影响研究。.(主要研究内容)本研究利用荧光定量PCR和western blot等技术，探索了胚胎附植前、中、后期梅山猪子宫内膜和胚胎等组织中EphA1, EphrinA1, EphB2, EphA4, EphB6的表达规律；再利用 RNAi技术沉默Ephrin A1，分析了猪子宫内膜上皮细胞之间的迁移和粘附能力；接着用转录组测序等技术分析了胚胎附植前、中、后期子宫内膜附植点的差异基因，鉴定出Eph-EphrinA1基因的信号通路。另外，本项目还资助研究了LEPR mRNA表达和SNP对苏猪胚胎附植期和脂肪沉积调控的影响，FTO对苏钟猪脂肪沉积的影响和苏钟猪LPL的组织表达谱及其生物信息学分析。.(重要结果) (1) Eph-EphrinA1, EphB2和EphB6的mRNA和蛋白表达量在梅山猪胚胎附植期均呈现先升高后降低的表达趋势，子宫内膜上皮细胞和滋养层细胞数量均逐渐增多。 (2) Eph-EphrinA1进行RNAi后，子宫内膜上皮细胞迁移能力将下降，证明其发挥促进胚胎附植的功能。 (3) Eph-EphrinA1对猪胚胎附植的调控通路为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，其上、下游基因分别为RasGAP和Fyn。(4) LEPR在猪胚胎着床中期子宫内膜附植点的mRNA表达量最高，另其在高脂肪含量猪的表达量显著高于低脂猪。(5) FTO和LPL对苏钟猪的皮下脂肪、心脏、肾脏、肌肉等组织的脂肪沉积有重要影响，且高脂猪背最长肌的表达量显著高于低脂猪背最长肌。.(关键数据) 猪胚胎附植时期Eph-EphrinA1基因的高表达有利于加强子宫内膜上皮细胞的迁移能力；LEPR同时参与了猪胚胎附植和脂肪沉积调控。.(科学意义) 对揭示猪胚胎附植和脂肪沉积调控机理有重要意义。 EphA1, EphrinA1, EphB2, EphA4 可成为猪高产仔数性状的重要候选基因，LEPR, FTO和LPL可成为猪高瘦肉率性状的重要候选基因。

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