新型流感病毒载体艾滋病疫苗诱导黏膜免疫反应的作用及机制研究

Induction of protective immune responses in rectal/genital tract is critical for AIDS vaccine research. Previously, we designed and constructed a novel influenza viral vector (JV, 2010), which could efficiently express large foreign genes in the respiratory mucosa in mice (Nat Commun, 2013). Based on this vector, we have generated experimental vaccine containing SIV gag/gp120 fragments and confirmed the expression of these antigens. However, whether these experimental vaccine can induce protective mucosal immune responses is not clear yet. The effects on HIV infection and the function mechanism need to be clarified. In this study, based on the previously established macaque model and immunoassay techniques (JV, 2012; JV, 2013), we intend to investigate the mucosal immune responses generated in the rectal/genital tract, especially the effector memory T cells , cytotoxic T lymphocytes and inhibitory antibody responses; then, we will chanllenge the monkeys with the highly pathogenic SIVmac239 virus, and detect the plasma viral load, SIV-infected mucosal CD4+ T cells and the escape mutations in SIV genome by using quantitative PCR, in situ hybridization, and genome sequencing technology. Finally, we will comprehensively analyed these results, clarify the effects of mucosal responses induced by novel influenza viral vectors on SIV infection, and elucidate its mechanism of function. This study will provid new insights for the design of an effective AIDS vaccine.

在直肠/生殖道黏膜诱导保护性免疫反应是艾滋病疫苗研究的关键。前期，我们在国际上率先构建了新型流感病毒载体（JV，2010），可携带更大的外源基因并在呼吸道黏膜高效表达（Nat Commun, 2013）。基于该载体，我们初步构建了携带SIV gag、gp120等抗原的实验疫苗，但尚不清楚这些实验疫苗能否诱导保护性黏膜免疫反应，对艾滋病毒感染的影响及作用机制是什么？本项目拟基于前期建立的猕猴模型及免疫分析技术（JV，2012；JV，2013），研究免疫后直肠/生殖道产生的黏膜免疫应答，尤其是效应记忆性T细胞、杀伤性T细胞及抑制性抗体反应；以高致病性SIVmac239黏膜攻毒，以定量PCR、基因组测序、原位杂交等技术研究血浆病毒载量、SIV逃逸突变及肠黏膜CD4+T细胞的感染情况。综合分析实验疫苗诱导的黏膜免疫反应对艾滋病毒感染的影响并初步阐明其免疫机理，为设计有效的艾滋病疫苗提供新的思路。

在黏膜部位诱导特异性免疫反应对于预防HIV经性途径传播至关重要。本课题集中于探索重组流感病毒携带HIV/SIV包膜抗原、核心抗原以及非结构抗原的创新策略，研究重组流感载体疫苗在动物模型的免疫原性，并以免疫原性较好的疫苗免疫猕猴以评估其诱导抗HIV/SIV黏膜免疫反应的能力。我们构建并成功拯救了携带SIV P27、tat等抗原的重组PR8载体，但其诱导细胞免疫反应的能力较弱，以Ad5载体疫苗加强后免疫反应显著增强。我们因此集中力量开展对流感载体的提升：1）以NP等表达水平较高的基因片段携带抗原基因；2）探索高容量PR8载体提升携载外源基因的能力；3）探索感染复制能力相对较强的重组WSN流感载体；4）研制新型腺病毒载体疫苗并评估其诱导黏膜免疫的能力，从而作为重组流感载体疫苗的加强疫苗。我们发现：1）NP片段可携载外源基因但传代稳定性较差，需要对包装信号改造以增强稳定性；2）NP片段表达报告基因的能力显著强于NA片段，稳定表达NP、NA的细胞株正在筛选；3）WSN株NA、HA片段携带外源基因在传代中快速丢失，需要对包装信号改造以提升稳定性；4）重组PR8携带HIV p24可诱导较强的细胞免疫反应，而展示HIV融合肽亦有潜力诱导广谱中和抗体；5）成功研制复制型及复制缺陷型重组Ad14、Ad55载体，阐明Ad14、Ad55主要中和表位，为研制加强疫苗奠定基础；6）Ad5载体疫苗滴鼻免疫可诱导偏向Th1的肺部T细胞免疫，显示其可作为黏膜加强疫苗。我们的结果证明重组流感载体可以携带不同抗原基因，其成功构建需要精巧的设计，同时也为未来进一步优化探索了可行的方向。由于猕猴实验周期长花费大，参考项目批准书中部分评审专家意见，即应获得有较强免疫原性的疫苗之后才开展猕猴免疫实验，我们暂未开展猕猴阶段的研究工作。我们计划2019年完成新型流感载体的探索及免疫原性研究，同时研制基于新型腺病毒载体的加强疫苗，然后选择较优的疫苗及免疫方案进入猕猴实验。项目执行期间发表SCI论文7篇，申请发明专利3项并授权2项，较好完成研究任务。

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