基于肿瘤EMT炎症微环境的Anti-TNFa-VHH-RGD4C融合纳米抗体设计及作用机制研究

Malignant tumor is the imbalance between cell proliferation and death disease, recurrence and metastasis is the leading cause of death. TNFa inflammatory factors in tumor microenvironment is the key factor of the promotion of tumor metastasis. At present, the commercial TNFa antagonists for tumor treatment have not significant effect . In preliminary study, self-developed TNFa minimized nanobody gathered in tumor site effectively, and can significantly inhibit breast cancer cell proliferation and EMT. In recent years, study found that integrin αvβ3 expressing on tumor cell surface was related with TNFa in inflammatory environment of tumor, TNFa promotes the expression of αvβ3, by αvβ3- FAK signaling pathways induced tumor metastasis; αvβ3 can regulate the effect of TNFa on tumor , integrin monoclonal antibody can inhibit TNFa mediating cell migration. Above all, this project the yeast expression system will be used to express the TNFa and RGD4C nanobody fusion protein, targeting to tumor site, synergistic inhibiting sTNFa and αvβ3, study the function and mechanism of breast cancer cell proliferation, metastasis, EMT and angiogenesis. In order to establish new tumor treatment strategy of antibodies against inflammatory factor to provide theoretical foundation.

恶性肿瘤是细胞增殖与死亡失衡的疾病，其导致患者死亡的首要原因是复发与转移。肿瘤炎症微环境中的炎症因子TNFa是促发肿瘤转移的关键因子。目前，商品化TNFa拮抗剂对肿瘤治疗的效果并不显著。项目组前期研究发现，自主研发的TNFa小型化纳米抗体在肿瘤部位有效聚集，并且能够显著抑制乳腺癌肿瘤生长及EMT发生。近年发现，肿瘤细胞表面过表达的整合素αvβ3与肿瘤炎症性环境中TNFα关系密切：TNFα促进αvβ3的表达，通过αVβ3-FAK信号通路途径诱导肿瘤转移；同时αvβ3单克隆抗体能够调控TNFa抑制其促肿瘤作用。鉴于TNFα与αvβ3的拮抗剂能够协同抑制肿瘤的增殖、转移，本项目利用酵母表达系统将TNFa纳米抗体与RGD4C蛋白进行融合表达，靶向肿瘤部位，实现对乳腺癌细胞增殖、转移、EMT及肿瘤血管生成的抑制作用，进一步阐明其作用机制。为建立针对炎症因子抗体的肿瘤治疗新策略提供理论依据。

三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer, TNBC）对当前的内分泌治疗方案不敏感，需探索新的治疗策略。研究发现，肿瘤发展过程中肿瘤微环境中低浓度的TNFα具有显著促进肿瘤细胞增殖和转移的作用，因此抗TNFα纳米抗体（VHH）具有治疗癌症的潜能。整合素αvβ3是肿瘤细胞膜上的一种受体，参与肿瘤细胞的粘附、增殖和转移。RGD序列是与αvβ3受体结合的最小识别单位，RGD4C为11个氨基酸的五元环形多肽，具有极强的αvβ3受体结合活性和组织渗透能力。本课题将两者构建形成RGD4C-TNFα融合蛋白，以期借助RGD4C的肿瘤靶向能力，促进VHH在肿瘤部位的聚集，提高VHH的抗肿瘤作用，同时延缓RGD4C的体内半衰期。首先通过基因工程技术构建了三种不同构型融合蛋白R-L-V-H、V-L-R-H、V-H-L-R重组载体，通过酵母表达系统pPICZα/GS115表达系统进行蛋白表达。对三种蛋白的细胞黏附功能和TNFα中和活性以及肿瘤增殖抑制作用进行综合评价，获得具有整合素αvβ3和TNFα双亲和活性的融合蛋白R-L-V-H，具有高表达量和抗体纯化效率。对其进行进一步体内外抗肿瘤活性研究，结果表明该种融合蛋白在体外能够显著性抑制MDA-MB-231细胞的增殖，转移和侵袭作用，Western blotting实验表明该蛋白可能通过抑制肿瘤转移相关信号通路PI3K-AKT和FAK通路中的相关蛋白表达，实现其抗乳腺癌作用。构建裸鼠MDA-MB-231荷瘤小鼠，进行10mg/kg的剂量皮下给药治疗三周。实验结果表明，该融合抗体蛋白与对照抗体Anti-TNF-VHH和生理盐水组比较，表现出良好的抑瘤作用，能够有效的抑制肿瘤的增殖，EMT转化和TNFα，HIFα蛋白的表达。总之，该项目的研究对与未来三阴性乳腺癌的药物的研究和开发具有重要的理论和实用价值。

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