基于KitL-PI3K- FOXO3a通路探讨温肾养血方提高卵母细胞质量的分子机制研究

In controlled ovarian hyperstimulation process, to obtain the high quality of the oocyte is one of the key factors to the success of in vitro fertilization - embryo transfer. In the clinical and experimental study we found that Wenshen yangxue decoction can promote follicular development, regulate the expression of ovarian local factors INH, ACT, FS. On this basis, this study intends to use 6-7 -week-old healthy female SD rats, with a focus on KitL- PI3K- FOXO3a signaling pathway , Using immunohistochemical and molecular biology technology, by observing experimental rats treated by Wenshen yangxue decoction, Wenshen decoction and yangxue decoction of the egg number ,high-quality follicle number, fertilization rate, cleavage rate, the number of 2, 4, 8 cell embryos, the influence of the blastocyst, morula number, oocyte Kit, PI3K, Akt, FOXO3a protein and granular cell KitL expression，using TUNEL staining to detect apoptosis in ovarian oocytes，to explore the mechanisms of Wenshen yangxue decoction improve oocyte quality and inhibit the apoptosis of oocytes, analysis the integration, synergy mechanisms and their differences of the Wenshen medicine and yangxue medicine, provide theoretical and experimental basis of treatment of ovulation disorders and improve the quality of oocyte .

在控制性超排卵用药过程中，获得高质量的卵母细胞是体外受精-胚胎移植成功的关键因素之一。在前期临床和实验研究中我们发现温肾养血方可以促进卵泡发育，调节卵巢局部因子INH、ACT、FS的表达。在此基础上本课题拟采用6-7 周龄健康雌性SD大鼠，以KitL- PI3K- FOXO3a信号通路为研究重点，利用免疫组化、分子生物学等技术，通过观察温肾养血、温肾、养血方对实验大鼠获卵数、优质卵泡数、受精率、卵裂率、2、4、8细胞数胚胎、囊胚、桑椹胚数的影响，卵母细胞Kit、PI3K、Akt、FOXO3a蛋白和颗粒细胞KitL的表达的情况及采用TUNEL荧光染色检测卵巢内卵母细胞凋亡变化，探讨温肾养血方提高卵母细胞质量、抑制卵母细胞凋亡的作用机制，分析方中温肾药和养血药整合、协同作用机制及其差异性，为温肾养血方辨证治疗排卵障碍，提高卵母细胞质量提供理论和实验依据。

卵母细胞的质量对于受精和胚胎发育具有深刻的影响。课题组前期研究表明温肾养血方可改善卵泡发育不良患者的卵巢功能状态，促进卵泡发育。最新研究表明PI3K通路对原始卵泡积累，初级向次级卵泡的过渡，卵母细胞生长和凋亡非常重要，卵母细胞的凋亡会影响后续卵子的正常受精和胚胎的正常发育。本课题采用8月龄健康雌性ICR小鼠，利用免疫组化、分子生物学等技术，以KitL-PI3K-FOXO3a信号通路为研究重点，通过观察温肾养血、温肾、养血方对卵母细胞发育和凋亡的影响，探讨温肾养血方提高卵母细胞质量、抑制卵母细胞凋亡的作用机制，分析方中温肾药和养血药的整合、协同作用机制及其差异性。研究结果表明温肾养血方、温肾方和养血方可以增加小鼠获卵数和生育数，显著提高高龄ICR小鼠的优质卵泡率、4细胞率、8细胞率、桑椹胚率、囊胚率，提高胚胎发育潜能，温肾养血方效果最显著。温肾养血方、温肾方和养血方均可提高小鼠卵母细胞和受精卵线粒体DNA拷贝数，温肾养血方效果最明显，温肾方次之。温肾养血方、温肾方和养血方通过调控KitL- PI3K- FOXO3a信号通路因子的基因和蛋白表达，提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能。温肾方侧重于提高PI3K-AKT的表达水平，增加受精率和卵裂率。养血方侧重于抑制FOXO3a及凋亡相关因子的表达，抑制卵母细胞凋亡。温肾方药可使肾气得充，气旺血生，温肾以化精生血，增强活血通络之功；养血方药寓活血于养血中，可使气机调畅，瘀血祛除，有利于温肾方药功效的发挥，所以与温肾方和养血方相比，温肾养血方能更好地提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能。

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