纳米组织工程技术联合抑制TGF-β1表达重建尿道的实验研究

The key of urethral reconstruction with tissue engineering is to prepare the scaffold with good structure and function which could provide an ideal growth microenvironment for seed cells and inhibit the formation of urethral scar. The extracellular matrix scaffolds don't have adequate mechanical strength, although its biocompatibility is good. In our previous study, we found that the nanometer fiber could mimic the extracellular matrix in the greatest extent because it has a high specific surface area, a high porosity, a high permeability and excellent biocompatibility. And it is easy to control the intensity form the industrialization. Transforming growth factor - β 1 (TGF- β1) is considered to be the important factor promoting scar formation. In our preliminary study, it showed that the down regulation of fibroblasts synthesis type I collagen and inhibition of scar formation could be achieved by constructed siRNA interfering TGF-β1 expression. We plan to adopt polycaprolactone / collagen / silk fibroin nanofibers as a scaffold, oral mucosa cells and fibroblasts as seed cells, to inhibit the expression of TGF-β1with siRNA interference technology, so that we can build the nano tissue engineering urethra which can effectively inhibit scar formation. This experimental study will explore the new strategy for urethral reconstruction and provide the theoretical basis and experimental basis for the clinical applications of nano tissue engineering techniques.

构建具有良好结构与功能的支架，为种子细胞提供理想的生长微环境，同时有效抑制尿道瘢痕的形成，是组织工程尿道重建的关键。天然的细胞外基质支架，其生物相容性虽较佳，但力学强度不足。我们前期研究发现纳米纤维其特有的高比表面积，高孔隙率，高渗透性可最大程度的模仿细胞外基质的天然结构，生物相容性佳，且可调控其强度，易形成产业化。转化生长因子-β1（TGF-β1）被认为是重要的促瘢痕形成因子。我们前期研究显示通过抑制TGF-β1表达，可减少胶原合成，促进其降解，防止瘢痕的形成。故本研究拟采用聚己内酯/胶原/丝素蛋白新型纳米纤维为支架，以口腔黏膜细胞和成纤维细胞为种子细胞，在此基础上，以siRNA干扰技术，抑制成纤维细胞TGF-β1表达，使构建的纳米组织工程尿道可有效抑制瘢痕的形成。以期探寻尿道重建的新策略，降低尿道狭窄的复发率，为纳米组织工程尿道重建技术的进一步研究和临床应用提供理论基础和实验依据。

本研究致力于构建聚己内酯/胶原/丝素蛋白新型纳米纤维支架，以口腔黏膜细胞和成纤维细胞为种子细胞，在此基础上，以siRNA干扰技术，抑制成纤维细胞TGF-β1表达，使构建的纳米组织工程尿道可有效抑制瘢痕的形成。课题组成功采用静电纺丝技术制备出聚己内酯／胶原／丝素蛋白电纺纳米纤维支架；将口腔黏膜细胞接种至纳米纤维支架表面，采用ＭＴＴ法和扫描电镜等评价聚己内酯／丝素蛋白／胶原电纺纳米纤维的细胞相容性。电镜结果显示所制备的电纺纤维直径均一，呈相互连通的多孔网状结构，口腔黏膜上皮细胞在改性后的材料表面具有良好的生长形态。从而证实了聚己内酯／丝素蛋白／胶原电纺纳米纤维支架，具备合适的孔径和孔隙率，细胞相容性良好，是一种组织工程尿道重建良好的支架载体。然后我们将siRNA转染兔成纤维细胞，通过RT-PCR 检测siRNA对兔TGF-β1TGF-B1表达的干扰效果，并选筛选出有干扰效果的siRNA；把筛选出的有最佳干扰效率的siRNA 重新转染兔成纤细胞。再以口腔黏膜细胞和转染后成纤维细胞为种子细胞，以制备的聚己内酯／丝素蛋白／胶原电纺纳米纤维作为支架，构建出更接近生理结构的组织工程口腔黏膜，并通过HE染色、扫描电镜对所构建的组织进行评价，结果显示口腔黏膜细胞和转染后的成纤维细胞在支架上生长良好并连接成片，复合效果良好。应用此组织工程材料来进行尿道狭窄的修复重建并设立对照组进行研究对比。研究结果显示联合应用口腔黏膜细胞和siRNA转染的成纤维细胞复合纳米支架进行尿道修复重建，尿道管腔通畅，瘢痕生成明显减少，修复处毛细血管生成明显增多，修复效果明显优于单用纳米纤维支架修复组。现研究结果，已发表中文核心期刊论著1篇，英文SCI收录论著2篇，申请获得实用新型专利1项，申请发明专利2项，已通过初审，公示中。

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