渤海海滨湿地螺旋藻、节旋藻资源调查及基于DNA序列分析的分类系统重建

Spirulina and Arthrospira are belong to oxygenic photoautotrophic prokaryotes, so they have both phytological and bacteriological characteristics,and were classified according to phytological or bacteriological principles by different scholars in different stages.This phenomenon result in forming situation that multiple and atypism taxonomic systems were coexistence, for example, the same strain of algae has different names, and different strain of algae has the same name. These disordered phenomenons of taxonomic system restrict further study and commercial application of Spirulina and Arthrospira. .In this project, we firstly investigate the resources of Spirulina and Arthrospira growing in diversified wetland of the Bohai seaside, and possibly obtain a lot of algae strains, On the one hand, it provide high-quality species of Spirulina and Arthrospira for various applied area, such as supply raw material for feed, food, medicines, cosmetics processing and so on, and solve the problem that farming species is unitary. On the other hand, the strains of algae from resources survey provide enough materials for taxonomic study in the project. .On the basis of resources investigation, the DNA molecules that are more conservative and able to reflect the different speed of evolution are used to analyse the phylogenesis of Spirulina, Arthrospira and the related species of Cyanobacteria, in order to find effective classficition index and method, to revise, replenish and consummate the original taxonomic system of Spirulina,Arthrospira and related species of Cyanobacteria, and finally propose a new taxonomic system that can be guide the identification practice for Spirulina and Arthrospira. The accomplishment of this project is not only foundation of theoretical and applied research for Spirulina and Arthrospira, but also an important support to improve the taxonomic system of Cyanobacteria. Meanwhile the project can fill the blank of domestic research about the resources survey and taxonomy of Spirulina and Arthrospira.;

螺旋藻、节旋藻是产氧光能自养型原核微生物，因兼具植物和细菌的特点，导致不同阶段、不同学者采用植物学或细菌学分类原则对其进行分类，形成多种分类系统并存但不一致的局面，出现同一藻株不同名称、同一名称不同藻株的混乱现象，限制了螺旋藻、节旋藻的进一步研究和应用。本项目以渤海海滨多样化的湿地为对象，进行螺旋藻、节旋藻资源调查，以其获得大量藻株，一方面为饲料、食品、药品等应用领域提供优质藻种，解决养殖藻种单一问题，另一方面为课题研究提供充足的分类材料。在资源调查基础上，选择相对保守且能够反映不同进化速度的多个功能基因进行螺旋藻、节旋藻及其相关属种的系统发育分析，旨在寻找有效的分类指标和方法，对原有的分类系统进行修正、补充和完善，提出可指导鉴定实践的分类系统。该项目的完成不仅是螺旋藻、节旋藻理论和应用研究的基础，是完善蓝细菌分类系统的重要支撑，而且也填补了国内在螺旋藻、节旋藻资源调查和分类研究的空白。

在渤海海滨及其周围湿地螺旋藻、节旋藻资源调查的基础上，将AB培养基与水样以不同比例混合富集目标藻体，采用毛细管显微单藻丝挑取法对其分离纯化，共获得103株螺旋藻、节旋藻纯培养。以纯培养藻株的基因组DNA为模板， PCR分别扩增16s rRNA、ITS、gyrB、ropB、ropC1、ropD、sigF、psbA、cpcA、cpcB、IGS、hoxY、rbcLX等基因，扩增产物直接测序或T-克隆后测序，得到的序列采用邻接法、最大简约法和贝叶斯法构建系统发育树，发现不同聚类方法构建的树状谱基本一致。其中16s rRNA、psbA和hoxY基因能够将供试藻株分为遗传距离超过属间标准的两个基因群，一个基因群包括了绝大多数供试藻株，另一个基因群藻株较少，且群内藻株形态多样、基因的同源性较低。ITS区域、16s rRNA V3-V4区域 和ropC1基因对供试藻株的区分度更高，可将藻株数量较多的基因群进一步分为两个亚群，但两个亚群是否为不同属或不同种，由于缺乏模式藻株，暂时无法做出判断。. 在分类时发现，不同形态或不同来源的藻株可归为同一基因群，相同形态或同一来源的藻株也可归为不同基因群，一些归为螺旋藻的藻株，其形态为直线形，这种现象不仅说明螺旋藻的命名不规范，而且意味着依据形态特征的分类系统与依据基因序列的分类系统存在较大矛盾。基于螺旋藻、节旋藻形态易受环境条件影响而发生变化的特点，课题组认为特征DNA序列应作为该类生物分类的主要依据。另外当依据的DNA序列不同时，藻株聚群的结果会存在微小差异，为此进行了全细胞脂肪酸为特征的化学分类，结果表明不同类群藻株的脂肪酸图谱存在明显差异，认为该特征可作为补充分类依据。. 在完成研究目标时，为了解决相关问题，还进行了如下工作：(1)以水样DNA为对象分析微型生物多样性与环境条件的相关性，发现温度、光照、pH值、总氮、总磷和聚球藻、浮丝藻及微囊藻等因素影响目标藻株丰度，为解决藻株富集困难提供新思路。(2)以不同形态藻丝体为对象，采用定量蛋白组学技术初步筛选到与形态建成有关的32种蛋白质，为形态易变原因的找寻提供依据。(3)以分离自官港湿地的TJSD091藻株为对象，研究温度胁迫应答机制，发现双组份信号传导、光合作用和脂肪酸代谢是藻株应激的主要反应，为形态、脂肪酸图谱、特征DNA序列分类权重的确定提供参考。

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