ARL2和ARL3及其相关蛋白调节感光细胞中膜蛋白的运输机制的研究

Intracellular protein trafficking is a key aspect for maintaining proper function of photoreceptors. Deregulation of protein trafficking caused by gene mutations leads to retinal degeneration. Previously we discovered that transport of isoprenylated proteins to photoreceptor outer segments is regulated by an isoprenyl binding protein PDEδ, while that of acylated proteins by an acyl binding protein UNC119. Recent in vitro experiments indicated that ARL2 and ARL3 facilitate release of isoprenylated proteins from PDEδ, and ARL3 also promotes dissociation of acylated proteins from UNC119. In order to test the in vivo role of ARL2 and ARL3 in regulating transport of membrane proteins, we plan to generate photoreceptor-specific knockout mice of Arl2 and Arl3 gene,respectively, and analyze trafficking and targeting of membrane proteins within mice lacking Arl2 or Arl3. Additionally, other evidence showed that the Retinitis Pigmentosa 2 gene encodes the GAP protein of ARL3. We will determine the disease mechanism of Retinitis Pigmentosa 2 by investigating membrane protein trafficking in Rp2 gene-deficient photoreceptors. In the end, we will purify and characterize the guanine exchange factors of ARL2 and ARL3 involved in regulating protein transport in photoreceptors. Completion of the experiments in this proposal will improve our understanding of the function of ARL2, ARL3, and their related proteins in regulating membrane trafficking in photoreceptors as well as the pathological mechanism of the RP2 disease.

蛋白运输对感光细胞的正常功能至关重要，蛋白运输异常最终会导致视网膜变性。已知感光细胞内异戊二烯化蛋白运输到外节段需要PDEδ的帮助，而脂酰化蛋白的运输则受UNC119的调节。 最近的体外实验表明，ARL2和ARL3这两个小G蛋白能促进异戊二烯化蛋白从PDEδ解离，而ARL3还能促使脂酰化蛋白从UNC119解离。为验证ARL2和ARL3参与调节感光细胞内膜蛋白运输，我们将制备感光细胞特异 的Arl2和Arl3基因敲除的小鼠并研究基因敲除对感光细胞内膜蛋白运输定位的影响。另有研究表明视网膜色素变性Rp2基因编码的蛋白是ARL3的GAP蛋白， 我们将分析Rp2基因缺失对小鼠感光细胞内膜蛋白运输定位的影响，确定RP2视网膜色素变性的病理机制。最后，我们将纯化鉴定参与ARL2和ARL3调节膜蛋白运输的的鸟苷酸交换因子GEF。完成本研究课题将增进我们对光细胞内的膜蛋白运输机制以及RP2病理机理的了解。

以前的研究表明，PDE6D是异戊二烯基化蛋白的结合蛋白，在感光细胞中调节异戊二烯基化的蛋白从内节转运到到外节。在PDE6D基因敲除的小鼠视网膜中，异戊二烯基化的蛋白，包括PDE6，GRK1和cPDE6不能正常被运输到感光细胞外节。ARL2和ARL3是小GPTase，能够分别和PDE6D相互作用，在体外调控PDE6D释放与之结合的异戊二烯基化的蛋白。 RP2基因是X染色体连锁的视网膜色素变性基因。 RP2蛋白是ARL3的催化蛋白，可以催化ARL3水解GTP。为了探索RP2，ARL3, 和ARL2基因在体内的功能，我们分别构建了RP2，ARL3和ARL2的基因敲除小鼠，并对这些小鼠的视网膜表型进行了系统的分析。 在RP2基因敲除的小鼠中，我们观察到视网膜的功能受到影响。 在分子水平上，异戊二烯基化蛋白，包括PDE6，GRK1和cPDE6的转运出现异常，而其他的蛋白的运输则不受影响。 在ARL3基因视网膜特异敲除的小鼠中，异戊二烯基化的蛋白的转运也受到影响，而且脂酰化的蛋白的转运的也受阻，与预期一致。ARL3基因敲除的感光细胞的外节比对照要短，表明ARL3不仅调节蛋白的运输，对感光细胞外节的形成也起重要作用。用AAV作为介质，在ARL3基因敲除小鼠视网膜中表达ARL3蛋白，可以起到部分恢复视网膜的功能和形态。 在ARL2基因视网膜的特异的敲除小鼠中，异戊二烯基化的蛋白的运输不受影响。但是该敲除小鼠的视紫红质和PDE6的表达大大降低，而且感光细胞的外节也比正常要短很多,表明ARL2不调节异戊二烯基化蛋白的运输，但对感光细胞外节的形成以及视紫红质和PDE6的稳定性起重要的作用。 通过该项目的实施，我们确立了RP2，ARL3和ARL3在体内的功能，并首次揭示了RP2基因突变导致的视网膜变性的分子机制，为将来研究这些基因导致视网膜疾病的治疗提供了适当的动物模型。

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