水稻A20/AN1型E3泛素连接酶提高抗逆性的分子机理研究

ZFP181 encoding an A20/AN1-type zinc finger protein, a novel E3 ubiquitin ligase, was identified as a stress-inducible gene in rice.The transgenic plants overexpressing ZFP181 restain plant growth and are more tolerant to drought stress and rice blight, which may be regulated by ubiquitin-26S proteasome pathway. In order to clarify the mechanism of ZFP181 in regulating growth and stress responses, we will focus on the following researches: the morphological and physiological basis of ZFP181 in regulating growth and stress responses; identification of the downstream proteins of ZFP181 by using the iTRAQ data; identification of ZFP181 interacting proteins and substrates by yeast two-hybrid assay and in vitro/vivo ubiquitination assays; comparision of the activity of 26S proteasome and the accumulation of ubiquitinated proteins in ZFP181 transgenic plants. Together, we will clarify the function and mechanism of ZFP181 in regulating plant growth, drought stress tolerance and disease resistance, which may provide the theorical basis for crop breeding in stress tolerance.

本研究前期鉴定了一个参与胁迫响应的A20/AN1型锌指蛋白基因ZFP181，其编码蛋白具有E3泛素连接酶活性。研究表明ZFP181抑制水稻生长,显著提高水稻抗旱性及白叶枯病抗性，推测其可能通过26S蛋白酶体途径调控生长发育并参与胁迫响应。为了阐明ZFP181的抗逆机制，本研究拟在已有基础上，开展以下研究内容：分析ZFP181调控生长发育及胁迫抗性的生理基础；根据蛋白组学数据鉴定ZFP181调节的下游蛋白并分析其可能的生物学功能；利用酵母双杂交筛选ZFP181互作蛋白，鉴定ZFP181的泛素化修饰底物并分析其生物学功能；分析ZFP181转基因植株中蛋白酶体活性及泛素化蛋白含量的差异。综合所有结果，揭示ZFP181在调控植物生长、抗旱及抗病过程中的功能及作用机制，为作物抗逆遗传育种提供理论依据。

ZFP181是一个与非生物胁迫有关的水稻A20/AN1型锌指蛋白，具有E3泛素连接酶活性，本项目在已有研究基础上研究了该基因的生物学功能及其介导的水稻抗性机制。主要研究成果如下：1）ZFP181 调控植物生长、抗逆的生理基础研究。利用过量表达和RNAi 抑制表达ZFP181 的水稻转基因植株，通过显微观察对转基因植株进行了细胞学分析，发现ZFP181过表达可抑制转基因植株细胞伸长，而不改变细胞数目。ZFP181 过量表达能够抑制转基因植株生长，同时比较了ZFP181 转基因及野生型植株中赤霉素含量差异，发现ZFP181过表达转基因植株中活性赤霉素含量显著降低，表明ZFP181通过调控赤霉素的水平影响水稻的生长发育；2）研究了ZFP181对泛素化蛋白含量和蛋白酶体活性的影响，发现正常生长和逆境条件下ZFP181过量表达转基因水稻均提高了泛素化蛋白含量，但是ZFP181对蛋白酶体活性影响不显著；3）ZFP181 的互作（底物）蛋白的鉴定。因前期发现ZFP181具有E3泛素连接酶活性，为了找到其作用的底物，通过酵母双杂交技术从水稻 cDNA 表达文库中筛选了ZFP181 的互作蛋白，进一步利用双分子荧光互补试验（BiFC） 技术对 ZFP181 互作蛋白进行了验证；4）ZFP181 的互作蛋白的功能分析。选取了一个ZFP181互作蛋白——类碳代谢抑制蛋白CCR4，利用其T-DNA插入突变体对CCR4进行了功能分析，发现与ZFP181的生物学功能相反，CCR4的缺失能够提高水稻抗盐性但抗旱性下降，为进一步解释ZFP181参与的抗逆机制提供了新的信息。利用体外泛素化实验验证ZFP181是否能对其互作蛋白CCR4进行泛素化修饰，结果发现ZFP181并不能对其泛素化，推测ZFP181可能通过与CCR4-NOT复合体互作，参与CCR4-NOT介导的RNA和蛋白代谢调控，通过调控胁迫相关基因表达及蛋白积累参与环境胁迫响应；此外，从蛋白质组学数据中，我们发现ZFP181能够与其下游的LEA蛋白发生互作，而且过量表达ZFP181能够显著促进OsLEA19蛋白的积累，推测LEA蛋白含量的增加可能是导致抗旱性提高的重要因素。

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