金针菇细胞毒素FTX抑制烟草花叶病毒的作用机制

The protein FTX, a kind of cytolytic toxin from Flammulina velutipes, can improve the permeability of cell bypass, promote the formation of the fruiting body of the Flammulina velutipes and inactivate the activity of TMV in vitro. The applicant determine that FTX has a strong inhibitive effect on TMV by genetically modified technology. After the infection of TMV, the symptom appearence of transgene tobacco was delayed, and the symptom of mosaic was reduced. What is the mechanism of this resistance formation? It will be analyzed from the following aspects: (1) study the virus replication after TMV infection in transgene tobacco, to clarify the relationship between symptom relief and virus volume, and identify the relationship between symptom relief and photosynthesis related enzymes in chloroplast by proteomic analysis. (2) explore the difference of induced resistance between FTX in vivo and in vitro, and analyze the differential expression of transcriptional group and proteome, to determine in which way FTX or its precursor substance TDP activate which signal pathway to induce plant resistance. The gene silencing technique was used to detect the receptor protein of FTX. (3) determine the growth promoting effect of FTX. The results will hopefully clarify the interaction between FTX、plants and TMV, analyze the antiviral mechanism of FTX, get the FTX activated tobacco related resistance genes, miRNA and siRNA differential expression status, and lay a theoretical foundation for the development of FTX as a biological pesticide.

金针菇蛋白FTX是一种溶细胞毒素，具有提高细胞旁通透性、促进金针菇子实体形成、体外钝化TMV等活性。申请人利用转基因技术确定FTX对TMV具有很强的抑制性，植物感染TMV后症状出现时间延后，花叶症状减轻，这种抗性特征形成的机制是什么？本项目将从以下方面进行分析：（1）研究转FTX烟草中TMV侵染后病毒复制状况以明了症状减轻与病毒量之间的关系、叶绿体中蛋白质组学差异分析明确其与光合作用相关酶之间关系。（2）探讨FTX体内外诱导抗性差异，利用转录组和蛋白质组差异表达分析FTX或其前体物质TDP是通过何种方式激活何种信号途径诱导植物抗性。利用基因沉默技术挖掘引起诱导抗性的FTX的受体蛋白。（3）确定FTX促生作用。结果将有望阐明FTX与植物、TMV的互作关系，深入分析FTX的抗病毒机理，获得FTX激活的烟草相关抗病基因、miRNA和siRNA差异表达状况，为FTX作为生物农药开发奠定理论基础。

利用生物活性物质作为候选农药是农业上防治病害的策略之一。FTX及其前体物质TDP是从金针菇中提纯的对烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）具有抑制活性的蛋白，在生物农药开发和抗病毒基因育种中应用潜力巨大，本项目就蛋白的抗性效果和机理进行了一系列的研究，结果如下：（1）构建了FTX及TDP蛋白的原核表达系统，在IPTG终浓度1mmol/L、温度37℃、诱导8小时表达量最高，利用镍柱对诱导表达后的菌体上清进行纯化，蛋白FTX及TDP在咪唑浓度为250mM时达到最高洗脱峰。（2）表达产物TDP效果优于FTX，对TMV侵染具有明显的保护作用，并显著抑制烟草中TMV的繁殖。TDP可与受体相互作用，激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径和NB-ARC，增加活性氧（ROS）和水杨酸（SA）的含量，从而促进过敏反应（HR）和系统获得性抗性（SAR）。SAR导致过氧化氢酶（CAT）、病程相关蛋白1（PR1）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和其他参与病原体防御的蛋白如CHI和细胞色素P450的表达增加。（3）利用农杆菌把FTX271转入本氏烟中并验证其抗性功能。单克隆抗体显示FTX271能在本氏烟中表达，其产物为TDP，转基因材料中一些基因、蛋白质和途径显著上调或富集，包括MAPK途径、HR标记基因H1N1和HSR203J、PR基因以及茉莉酸（JA）信号通路的关键基因COI1和脂氧合酶基因LOX2，表明FTX271可能激活MAPK通路，增加ROS和JA的含量，从而促进HR和诱导性系统抵抗（ISR）。此外，转基因烟草可能使用sHSP辅助的光修复来减轻TMV的症状。总之，TDP可体外诱导SAR保护烟草免受TMV感染。但在转基因植株内JA介导的ISR和sHSP辅助的光修复被FTX271激活，以保护烟草免受TMV感染并减轻病毒引起的症状。项目不仅就FTX在体内外对TMV的抑制机理提出较全面的观点，那就是系统性的诱导植物的抗病毒活性，但抗性途径不同。而且项目组还获得了具有抗病毒活性的TDP原核表达系统及转基因材料。这在理论上阐明了FTX与植物、TMV三者之间的互作关系，为转基因育种和蛋白作为生物农药开发提供理论依据,并为其他类似抗植物病毒蛋白的研究提供借鉴。在实践中则为烟草抗病育种提供了优质的新基因资源。

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