基于蛋白质组学的结核靶向CT造影剂的分子靶标及动物实验研究

The tuberculosis diagnosis is still difficult, the research on targeted contrast agent is a new way of imaging diagnosis of tuberculosis. To search for the special protein to be the molecular target, we connect subcellular membrane proteomics of Mycobacterium tuberculosis (Mtb.) in vitro and proteomics of Mtb. in vivo in the murine model of acute tuberculosis infection, with 2DE/MS and iTRAQ labeling quantitative technology respectively. According to the two approaches, we screen the proper protein as the molecular target for targeted contrast agent. Then use this protein-specific antibody to do the immunohistochemistry test in human samples of pulmonary tuberculosis and normal, which is to ensure the repeatability. At last, we make the targeted contrast agent with the monoclonal antibody couple one or some iodine atoms. And then with it to do Micro-CT scans and pathology analyses in the acute tuberculosis infection of murine model. We hope to make a breakthrough in the field of imaging diagnosis of tuberculosis.

结核病诊断仍是难点，靶向造影剂的研究为结核影像诊断开辟了新的方向。为优选结核特异性造影剂的分子靶标，本研究综合体外环境中结核杆菌亚细胞水平膜蛋白质组学研究，和小鼠感染结核模型的宿主体内结核杆菌的蛋白质组学研究，分别应用2DE/MS和iTRAQ标记的定量蛋白质组技术，两种方法互补筛选适用于制备靶向CT造影剂的膜蛋白质作为分子靶标。以该蛋白质为抗原制备单克隆抗体，在临床肺结核病人及正常人的肺组织样本中行免疫组化验证，保证实验的可重复性。最后单克隆抗体耦连碘原子制备出靶向造影剂，在小鼠急性感染结核模型中行Micro-CT扫描分析及病理对照研究，以期在结核病影像诊断领域有所突破。

目的.建立肺结核感染小鼠模型，筛选可作为靶向造影剂的分子靶标，合成CT-荧光双模态靶向探针，观察结核感染小鼠模型的CT-荧光双模态成像效果。.方法.1）滴鼻法建立小鼠急性肺结核模型，探讨感染不同时期的病理改变及其micro-CT动态演变特征。.2）进行了小鼠感染结核模型的宿主差异蛋白质组学研究和宿主体内结核杆菌的蛋白质组学研究，分别应用2DE/MS和鸟枪法筛选靶标。.3）从宿主免疫细胞入手，研究肺结核小鼠模型的T细胞耗竭抗原（LAG-3、TIM-3、CTLA-4和PD-1）表达情况，筛选靶标。.4）选定靶标，应用荧光金纳米团簇（Au NCs）合成CT-荧光双模态靶向探针，观察探针体外CT-荧光成像效果，检验分子探针的稳定性、组织学及细胞学毒性、药物代谢动力学。.5）再次建立急性感染肺结核小鼠模型，分别尾静脉注射Anti-TIM3@Au NCs，Au NCs以及碘海醇，对比各组肺结核病灶的CT增强效果及离体器官的荧光成像效果。.结果.1）成功建立小鼠急性感染肺结核动物模型，其micro-CT表现随疾病发展有一定的变化规律。.2）蛋白质组学方法筛选出结核分支杆菌表达的膜蛋白质MtrB（Rv3245c）；从宿主免疫细胞入手，筛选出小鼠T细胞耗竭抗原TIM-3。.3）应用Au NCs合成了Anti-TIM3@ Au NCs作为CT-荧光双模态探针。.4）Anti-TIM3@ Au NCs探针成像效果优于对比组，具有显著统计学差异（P＜0.001，α＝0.05）。.结论 .1）Micro-CT可动态监测肺结核小鼠的肺部病变发展过程。.2）筛选出TIM-3作为制备CT-荧光双模态靶向探针的靶标。.3）纳米金材料可以实现肺结核小鼠模型CT、荧光双模态成像，其成像效果优于碘对比剂，TIM3@Au NCs CT-荧光双模态探针的成功制备为今后结核靶向探针研发提供了新的思路。

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