CLCN5基因2种新突变致低分子蛋白尿的机制研究

Protein CLC-5 encoded by CLCN5 gene is one of the molecules constitute a complex of endosome, which play a key role in the tubular reabsorption of protein. Dent disease characteristic of low molecular weight proteinuria is caused by CLCN5 mutation and many children developed chronic renal failure,resulting in renal tubular epithelial cell endocytosis dysfunction. However, to date, CLCN5 gene mutation effects were rarely reported .In previous study ,we had found two novel mutation IVS3-2A> G and L594fsX595.We will experiment in vitro and in vivo experiments at the molecular, cellular and whole organism level , using the patch clamp, confocal laser, Real-Time ,Western-blot, Rnock-in to observe the impact of the CLC-5 mRNA and protein expression, distribution and function, internal endosome complex functions and their associated molecules expression and distribution; in order to reveal the molecular mechanisms of urinary protein reabsorption in the renal tubular epithelial cells and renal interstitial fibrosis.

CLCN5基因编码的氯离子通道蛋白CLC-5是构成肾小管上皮细胞内吞体复合体的分子之一，后者在肾小管重吸收蛋白中起关键作用。以低分子蛋白尿为主的Dent病是CLCN5突变引起的肾小管上皮细胞内吞功能障碍所致，多数患儿发展为终末肾衰竭，然迄今，鲜有关CLCN5基因突变效应研究。为此，本研究将对前期工作中发现的2种CLCN5基因IVS-3A＞G和L594fsX595新突变进行功能研究，通过体外和体内实验，采用膜片钳、激光共聚焦、Real-Time、Western-blot、knock-in等技术手段，在分子、细胞和整体水平研究这2种新突变对CLC-5 mRNA和蛋白的表达、分布及功能的影响；对内吞体复合体功能及其相关分子表达、分布的影响；对细胞骨架蛋白表达和分布的影响，对肾小管上皮细胞转分化的影响及其可能的分子机制，揭示尿蛋白在肾小管上皮细胞重吸收及肾小管间质纤维化的分子机制。

CLCN5 基因编码的氯离子通道蛋白 CLC-5 是构成肾小管上皮细胞内吞体复合体的分子之一，后者在肾小管重吸收蛋白中起关键作用。以低分子蛋白尿为主的 Dent 病是 CLCN5 突变引起的肾小管上皮细胞内吞功能障碍所致，多数患儿发展为终末肾衰竭，然迄今，鲜有关 CLCN5 基因突变效应研究。为此，本研究将对前期工作中发现的 2 种 CLCN5 基因 IVS-3A＞G 和 L594fsX595 新突变进行功能研究。通过构建载体、细胞培养、Real-Time等技术，在分子和细胞水平研究这 2 种新突变对 CLC-5 mRNA功能的影响，来初步探索 CLCN5 基因 2 种新突变的突变效应。. 成功获得测序正确的载体pcDNA3.1(+)/EGFP/IRES-CLCN5，pcDNA3.1(+)/EGFP/IRES-D4，pcDNA3.1(+)/EGFP/IRES-T2，转染293细胞QPCR检测clc-5、Megalin、Cubilin、NHE3、V-H+-ATpase基因的表达。获得QPCR结果扩增曲线正常。与293-clcn5组比较，293-D4目的基因Megalin、V-H+-ATpase表达量明显降低；293-T2组目的基因Megalin、V-H+-ATpase表达量无明显变化。与对照组相比，两组cubilin、NHE3基因表达量无明显变化。由此提示：CLCN5 基因 IVS-3A＞G 和 L594fsX595 突变致内吞体复合物分子中Megalin、V-H+-ATpase功能异常进而导致肾小管重吸收功能异常，进而引起Dent病小分子蛋白尿产生。

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