新型pfDHODH抑制剂结构优化和作用机理研究

Dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) is the key enzyme which catalyzes the fourth step in the de novo pyrimidine biosynthesis. pfDHODH has become a new validated target for the development of novel antimalarial agents, because the malaria parasite relies exclusively on the de novo biosynthesis pathway for pyrimidine biosynthesis. In this study, on the basis of D01 discovered through structure-based virtual screening method and D10 with the highest pfDHODH IC50 of 3~5 nM derived from D01, rational structural optimizations of this series compounds were carried out from CADD (computer aid drug design), medicinal synthesis and the bioactivity evaluation. To study the action mechanism and structural activity relationships of D01 series, X-ray crystal structure of pfDHODH with D01 series inhibitors will be cultured and analyzed. Some inhibitors with high activity, high selectivity, good drug-like properties will be obtained from further structural and physicochemical properties optimizations, preliminary vitro cell studies in pf 3D7 and pf Dd2 cell lines, which will lay a foundation for the next vivo pharmacokinetics studies and obtain novel antimalarial drugs with independent intellectual property rights.

双氢乳清酸脱氢酶（DHODH）是催化嘧啶从头生物合成过程中的关键酶，嘧啶从头合成是恶性疟原虫合成DNA、RNA唯一的嘧啶碱基来源。因此，疟原虫pfDHODH成为有效的抗疟疾药物的靶点。本研究前期通过化合物库的分子虚拟筛选获得了新颖pfDHODH抑制剂母核D01，经过初步优化获得高活性化合物D10（IC50 值3~5 nM）。本项目拟结合计算机辅助药物设计，进行先导化合物结构优化、药化合成，通过体外酶水平活性、选择性对化合物进行评价，结合复合物晶体培养和结构解析，研究该系列抑制剂的作用机制；在此基础上，开展进一步的结构、理化性质优化，研究其抑制pfDHODH的构效关系及成药性研究；完成初步的细胞（pf 3D7和pf Dd2细胞株）活性及初步的体内药效学研究。拟获得高活性、高选择性、理化性质良好的抑制剂结构，为后期开展的进一步体内药效学研究，进而获得具有自主知识产权的创新抗疟药物奠定基础。

本课题基于二氢噻吩酮类化合物101及其初步构效关系，分别针对结构中亲水部分和疏水部分进行衍生修饰，并采用骨架越迁策略，得到了多个系列结构新颖、高选择性且高效的二氢噻吩酮、二氢呋喃酮等骨架的PfDHODH抑制剂，获得多个高活性化合物，如115、132、140、143、144的酶水平IC50达到6-65nM水平，其中，化合物140酶水平和细胞水平抑制活性和选择性（IC50 = 6 nM，Pf3D7 IC50 = 15 nM，PfDd2 IC50 = 18 nM；对hDHODH选择性达到14000倍）均超过已报道的所有同类抑制剂。然而，高活性化合物活体抗疟实验结果与抗疟药物有差距。为此，开展了系统的体内外代谢稳定性实验研究，药代动力学研究证明，尽管高活性化合物140表现出较好的药代动力学性质，其生物利用度达40%，但140体内暴露量较低，最大血药浓度、半衰期、AUC面积与现有抗疟药物相比仍有差距。因此，根据代谢产物推测的结构中不稳定代谢位点，开展第二轮结构优化工作。优化结构活性测试结果显示，针对酯基不稳定性改造所得的衍生物152，体外活性较优（IC50 = 17 nM），同时保持了对hDHODH良好的种族选择性，拟开展进一步体内活性评价。.针对新颖结构的高活性PfDHODH抑制剂开展了分子水平机制研究，经过大量实验优化，培养并解析了140与PfDHODH蛋白的复合物晶体结构，明确了该抑制剂的结合模式与作用机理，为后期的成药性与药代动力学改造提供了优化方向。综合前期结构优化结果，采用通过环化固定结构中两个羰基取向，并保证与组氨酸的氢键相互作用，获得一系列二氢呋喃酮并嘧啶（2,3-dihydrofuro[2,3-d]pyrimidine-4,5(1H,6H)-dione）衍生物，其中化合物208（IC50 = 23 nM），活性高于DSM1，且选择性依然保持，我们推测母环结构的整体稳定性也因六元环的存在而得到了一定的提高，有可能成为一类全新结构pfDHODH抑制剂，准备开展进一步体内和代谢活性研究。.以本课题发现的高效抑制剂（140）为配体，设计并合成化学荧光探针，运用探针的荧光强度判断恶性疟原虫在红细胞内的位置及感染率很有意义。通过等温量热滴定法及热迁移实验验证了140与PfDHODH的靶向结合作用（KD=75.2 nM，△Tm=7.5 ℃），基于该复合物晶体结构设计合成了

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