葡萄microRNA398及其靶基因响应波尔多液中Cu2+的机理

Grape (Vitis vinifera) is an important fruit tree in the world. It is also one of the fruit tree species vulnerable to various diseases. Bordeaux mixture, one of the most common copper fungicides, was first and commonly applied in the grape disease prevention with good effect. It is noticed that people overlooked the influence of Bordeaux mixture to grape trees and the response of grape trees to extra Cu2+ in the spray. MicroRNA398 (miR398) and its target genes play a vital role in the process of regulating copper metabolism balance and response to the copper stress. Based on the mentioned above, this research is designed to understand Vv-miR398's regulation on its target genes and the role both of Vv-miR398 and its target genes in responding exogenous copper stress, for which Western blotting, qRT-PCR, PPM-RACE and RLM-RACE, and miR-RACE technologies will be applied. This research is important for our understanding the role of Vv-miR398 and its target genes in copper stress response network of grape and resistance to copper stress. Its accomplishment can definitely provide significant theory for the better use of Bordeaux mixture in grape and even in agricultural and forestry production.

葡萄(Vitis vinifera)是世界性的重要果树，也是容易遭受病害的果树树种之一。波尔多液是葡萄病害防治中使用最早、最普遍，也是应用效果很好的含铜杀菌剂。人们满足于波尔多液杀菌的功效时，却忽略了波尔多液对葡萄树体本身的影响以及葡萄对喷施波尔多液后出现的过多外源Cu2+的响应。鉴于microRNA398（miR398）及其靶基因在调节植物铜代谢平衡、应答铜胁迫过程中扮演的重要角色。本研究拟通过Western杂交、定量RT-PCR、PPM-RACE和RLM-RACE技术、miR-RACE技术等，明确Vv-miR398对靶基因的调控方式以及Vv-miR398与靶基因应答葡萄外源铜胁迫的生物机制。这对了解Vv-miR398及其靶基因在葡萄铜胁迫应答网络中的作用与葡萄抗铜胁迫能力至关重要，对于更好地利用波尔多液服务于葡萄乃至农林生产等具有重要理论指导意义。

铜(Cu)是植物生长发育所必需的微量营养元素，在众多生理过程中扮演重要角色。但过量的铜对植物是十分有害的，可以导致大量活性氧自由基的产生，诱导DNA损伤、蛋白质氧化、膜质过氧化等，进而影响植物一系列生化反应和生理过程。葡萄(Vitis vinifera L.)是世界性的重要果树，也是我国最为重要的经济果树之一。随着含铜杀菌剂在葡萄生产中的广泛应用，葡萄铜胁迫逐渐成为影响葡萄生产的重要挑战。本研究利用高通量测序、RT-qPCR、转基因、miR-RACE等技术，初步阐释了葡萄应答铜胁迫的分子机理，并对细胞自噬在植物响应非生物胁迫中的作用做了初步的探索。结果表明，在高铜胁迫下，SOD、POD和CAT酶活性增加来保护植物免受铜胁迫伤害，铜转运体、铜分子伴侣和P型ATP酶编码基因也在不同程度上应答外界铜浓度的变化。通过转录组测序发现了很多已知的和新的Cu诱导或抑制基因。生物学分析表明，铜胁迫下，抗氧化酶、热激蛋白、病程相关蛋白及次级代谢产物等ROS清除系统均被强烈诱导。通过小RNA高通量测序共鉴定了158条保守miRNAs和98条新miRNAs，在保守miRNA中，miR398在铜胁迫下表达下调最为显著。RT-qPCR结果显示Vv-miR398与VvCSD之间存在着负调控关系，而VvSPL7与Vv-miR398之间存在着正调控关系。结合转录组数据和RLM-RACE分析表明葡萄miR398能介导CSD1和CSD2裂解，通过转基因功能验证，表明在烟草中过表达葡萄CSD1和CSD2均能提高植株耐铜性。此外，进一步研究发现细胞自噬也参与了葡萄应答铜胁迫过程，并在草莓抵抗非生物胁迫中发挥着一定的作用。本项目的完成初步阐释了葡萄应答铜胁迫的分子机理，为生产中葡萄耐受高浓度铜胁迫提供了理论依据，也为进一步系统研究细胞自噬如何参与应答葡萄铜胁迫过程奠定了基础。

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