基于CRISPR-Cas技术调控Clostridium sp. WST利用琼胶多糖转化生物丁醇效率的研究

In China coastal line, there are a lot of the renewable algal resources, which contains polysaccharides. If they can be efficiently utilized as substrate for the bioconversion of renewable biomass into liquid fuel, it will be helpful to solve the present problems of environmental pollution and energy crisis. Based on this, this project intends to construct an agarase hydrolysis system and biobutanol fermentation platform, with butanol fermenting strain Clostridium sp. strain WST as the research object, to improve the conversion efficiency from agar polysaccharide to biobutanol. First of all, with the metabolic engineering method, agarase genes, Aga575 and NH852, will be transformed into strain WST and extracellular expression successfully with secretory expression system (eglA), which can accelerate the production rate of agar polysaccharide to galactose and eliminate the complicated steps of adding hydrolase. Further, based on the complete genomic information of the strain WST, acetoacetate decarboxylase (adc) gene and NADH-quinone oxidoreductase (nuoG) gene, which could inhibit acetone production, and regulate the NADH reducing power equivalent, respectively, will be knocked out by the technique of CRISPR-Cas9, resulting in higher final butanol production and yield. It is expected that the research results will be achieved through the acquisition of a new type of engineered bacteria, to realize the bioenergy conversion process and promote the sustainable utilization of the algal polysaccharide, which will lay the foundation for the development of marine biomass.

中国沿海拥有大量可再生的藻类资源，富含多糖类物质，如能有效地进行生物转化成为液体燃料，有利于解决现阶段的环境污染及能源危机问题。基于此，本项目计划以丁醇高效发酵梭菌菌株WST为研究对象，围绕调控并提高其利用琼胶多糖转化生物丁醇的效率，首先采用代谢工程的手段，将琼胶酶基因Aga575和NH852导入到菌株WST中，并利用分泌表达体系(eglA)实现琼胶酶的胞外表达，加速琼胶多糖到半乳糖的产生速率，消除了外加水解酶的复杂步骤；其次，在获取菌株全基因组序列信息的基础上，通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术敲除乙酰乙酸脱羧酶(adc)和NADH-醌氧化还原酶基因(nuoG)可以分别阻断丙酮合成和维持细胞内NAD(P)H和ATP浓度，以进一步提高发酵产物中丁醇的产量和纯度。预期研究成果将通过新型工程菌的获得，实现海藻多糖的生物能源转化过程，促进海藻多糖可持续利用，为开发海洋生物质能奠定基础。

海洋生物质的主要来源为海洋藻类，具有生长空间自由、生长速度快、多糖含量高且木质素含量低等特点，中国沿海拥有大量可再生的藻类资源，如能有效地将其转化生物燃料，将有利于解决现阶段的石化能源带来的环境污染问题。生物丁醇作为一种新型生物燃料，主要是由产溶剂梭菌经丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵途径合成，而目前原料成本高、菌株转化率低及副产物比例高等问题阻碍了生物丁醇的工业化生产的进程。因此，需要建立一种高效且经济的发酵体系来解决上述难题，在提高丁醇产量同时降低发酵成本，以最终实现工业化规模生物丁醇发酵的过程。本项目主要通过改造优势产醇梭菌，在结合多组学分析与CRISPR基因编辑技术的基础上，从分子水平上重构微生物细胞的碳代谢流，建立有效且高效的生物转化有效途径，成功实现工程菌株将以琼胶多糖、石花菜为代表的海藻生物质直接转化为生物丁醇、丁二醇、异丙醇等高附加值产品的过程。.首先，构建基于梭菌胞外表达体系实现异源琼胶酶系的表达，首次实现工程菌株直接利用琼胶多糖直接转化生物丁醇的过程；其次，利用搭建CRISPR-dCas基因编辑平台，实现调控碳流与细胞内还原力水平，提升生物丁醇合成效率；再次，通过过表达促进副产物丙酮转化的相关基因，在降低丙酮积累的同时实现转化异丙醇和丁二醇等高附加值产物的合成；最后，成功搭建基于丁酸水解的红藻多糖转化生物丁醇体系并应用于工程菌株的转化过程。相关研究成果将拓展海藻生物质在能源物质转化方面的应用，并逐步建立具有自主产权的、有潜在工业应用前景的“海洋生物质微生物能源发酵工厂”，推动生物质能开发的工业化生产进程。

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