含OsmC结构域的新型双结构域酯酶的催化机制及其生理功能研究

Two-domain proteins with an osmotically inducible protein C (OsmC) domain and a α/β hydrolase domain are present in many genome sequences of marine bacteria. However, the catalytic properties and physiological role of these two-domain proteins is still unknown. Est22 is a novel two-domain esterase from marine bacterium isolated from arctic surface water, containing an OsmC domain and an Abhydrolase_5 family hydrolase domain. This project intends to study Est22 to illustrate the catalytic properties, catalytic mechanism and physiological role of two-domain proteins containing an OsmC domain. The esterase activity and peroxidase activity of Est22 will be biochemically characterized, and the impact of OsmC domain on the esterase activity of Est22 will also be studied. Structural analysis in combination with mutational and biochemical analysis will reveal the catalytic mechanism of Est22 against esters and/or peroxides and the structural basis for domain-domain interaction. Transcriptional and western analysis under different conditions will tell the expression pattern of Est22, and gene knockout and complementation experiments will show the role of Est22 in environmental adaption of marine bacteria. Our results in this project will provide important basis for illustrating the mechanism for adaption of marine bacteria to polar extreme environments.

含OsmC（Osmotically inducible protein C）结构域和α/β水解酶结构域的双结构域蛋白存在于多个海洋细菌的基因组序列中，但是，关于这类酶的催化特性及其生理作用目前还不清楚。Est22是北极表层海水细菌产生的一个含潜在过氧化酶OsmC结构域和Abhydrolase_5水解酶结构域的新型酯酶。本项目拟以Est22为例研究含OsmC的双结构域酶蛋白的催化特性及其生理作用。首先研究Est22的酯酶活性、过氧化酶活性及OsmC结构域对其酯酶活性的影响，揭示Est22的催化特性。其次，通过结构分析、突变和生化分析，阐明Est22降解酯类和/或过氧化物底物的分子机制及其两个结构域间相互作用的结构基础。最后，通过RT-qPCR分析、蛋白质印迹分析、基因敲除和回补实验，揭示Est22在菌株适应极地海洋环境中所起的生理作用。研究结果将为阐明极地海洋细菌的环境适应机制提供重要依据。

OsmC是一类受渗透压诱导的硫醇依赖型过氧化酶，参与细胞氧化应激防御反应。酯酶结构域可结合OsmC结构域，形成双结构域酯酶。含OsmC的双结构域酯酶存在于多个海洋细菌中。但是，到目前为止，关于这类酶的催化特性及其生理作用还不清楚。本项目中，我们对北极海洋细菌来源的新型酯酶Est22及其同源蛋白进行了异源表达和分离纯化，并对其酶学性质进行了研究。生化分析表明，双结构域酯酶为耐盐的碱性低温酶，这有助于其来源菌适应低温含盐的极地海洋环境。OsmC结构域的缺失不影响酯酶结构域的比活力和底物特异性，但是降低了酯酶结构域的热稳定性。为了研究这一类新型酯酶的催化机制，我们解析了Est22同源蛋白—E45的晶体结构。E45在晶体和溶液中均形成二体。结构上，两个单体主要通过OsmC结构域间相互交叉排列而形成稳定的二体。两个酯酶结构域反向平行排列，呈经典的α/β水解酶折叠结构。通过结构和突变分析揭示出酯酶结构域对酯类底物的水解依赖于催化三联体Ser106、Asp196和His225。OsmC结构域远离酯酶结构域的催化腔，因而OsmC结构域不会影响酯酶活性。两个酯酶结构域间虽然存在相互作用，但是作用面较小。而OsmC结构域间通过相互交叉排列使全酶形成紧密的二聚体，在一定程度上增强了E45中两个酯酶结构域间的相互作用，从而提高了其热稳定性，揭示出OsmC结构域影响E45酯酶热稳定性的结构基础。比较结构分析揭示出，E45中OsmC的二聚体形成方式和催化机制显著不同于已报道的OsmC/Ohr蛋白。不同于已报道的OsmC/Ohr（其活性中心的成对Cys催化残基所在的两个α螺旋均来自同一个OsmC/Ohr单体），E45中OsmC的成对Cys催化残基所在的两个α螺旋分别来自两个OsmC结构域。系统发育分析表明，双结构域酯酶中的OsmC形成一个独立的进化分支，表明双结构域酯酶中的OsmC可能代表了一个新的过氧化酶类群。通过基因敲除和回补实验，揭示出敲除株在H2O2存在条件下的存活率显著低于野生型，进一步表明双结构域中的OsmC具有过氧化酶活性，这有助于其来源菌抵抗过氧化物等环境压力的影响，阐明了含OsmC的双结构域酯酶的潜在生理作用。

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