核酸化学修饰偶联和光交联新技术在非编码RNA研究中的应用

Up to now, it has found only 2% protein-coding genes in the human genome, but 80% human genes have a biological function, and up to 90% DNA of the genome transcribed into RNA, majority of which are non-coding RNAs. Studies have shown that non-coding RNA involved in regulating the almost all life processes, as well as the abnormal expression of non-coding RNA is associated with many major diseases. But so far the functions and roles of non-coding RNA just is the tip of iceberg, desperately needs new tools and technologies for the breakthrough research of non-coding RNA. This project is based on the core technologies of "photo-crosslinking", "Click" chemistry, locked nucleic chemistry (LNA) and nucleic acid conjugation chemistry,to develop methods of non-coding RNA research tools (such as CLIP, CLIP-seq and RIP-seq), the interactions of non-coding RNA and RNA-binding proteins, non-coding RNA localization and functions in cell.

人类基因组中编码蛋白质的基因只占不到2%，至今发现至少80%人类基因具有生物学功能，而多达90%的基因组DNA转录为RNA，其中绝大多数为非编码RNA。研究表明，非编码RNA几乎参与调节生命的所有过程，并且许多重大疾病与非编码RNA的异常表达有关,但至今对非编码RNA的发现和研究仅局限于冰山一角，迫切需要突破性的新技术和新方法应用于非编码RNA研究。本项目基于“光交联”、“点击”化学、锁核酸和靶向修饰等四项核酸关键技术，开发非编码RNA (CLIP、CLIP-seq、RIP-seq)、蛋白与非编码RNA相互作用、非编码RNA特别是lncRNA定位、功能等研究新方法，为非编码RNA研究提供有力工具。

非编码RNA的发现和功能研究刚刚开始，迫切需要开展新技术、新方法研究。本项目以“开发非编码RNA研究新技术、新方法”为目标，基于“光交联”、“点击”化学、锁核酸、核酸修饰和偶联等核酸化学技术，开发非编码RNA的研究新技术,包括：RNA-蛋白相互作用检测新方法（非放射性标记CLIP、CLIP-seq）、RNA结合蛋白高通量鉴定技术RICK、增强的lncRNA的荧光原位探针和抑制剂以及蛋白-RNA新光交联剂开发等；在项目的实施过程中，我们开发了非放射性RNA标记的光催化核糖核苷增强交联和免疫沉淀法（PAR-CLIP）新方法，该方法利用“点击”化学将插入新生RNA的EC标记荧光、生物素等可识别的分子，简化了PAR-CLIP方法的步骤并且安全可靠；通过利用“点击”化学将新生插入EU核苷的RNA标记生物素进行RNA蛋白复合物分离纯化，开发了高通量鉴定RNA结合蛋白的RICK（RNA Interactome using ClicK chemistry）方法。该方法可以高效、准确的鉴定所有类型的新生RNA结合蛋白，通过该方法成功鉴定了295个尚未报道的全新RNA结合蛋白。目前基于“光交联”的RNA蛋白结合研究技术正在进一步开展中。通过本研究开发的创新方法为研究蛋白与非编码RNA之间的相互作用、非编码RNA在细胞和组织中的定位和功能以及非编码RNA与结合蛋白的调控网络和作用机制研究提供有力工具和技术支持。

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