基于肝炎病毒嗜肝性对hESC-derived hepatocytes 体外分化过程中的关键因子分析

It is necessary to improve the directed differentiation of human stem Cells into hepatocytes. But the key factors during differentiation from hepatoblast to mature hepatocytes are still unknown due to the restriction of deficiency of hepatocyte-specific markers. In our previous work, we have.successfully differentiated human embryonic stem cell into hepatocytes (hESC-Heps) and modeled hepatitis viral infection, which reflected the characteristics of primary human hepatocytes authentically (Zhou XL, et al. Stem Cell Reports, 2014). This project aims to find out.the key factors during differentiation of hESC-heps based on the hepatotropism of hepatitis virus (HBV/HCV). It includes three parts 1) stably differentiate hESC into hESC-Heps and sort out the mature and immature hESC-Heps by HBVpp/HCVpp systems and production of hepatitis virus using FACS; 2) analyze gene expression profile between these hESC-Heps and select out the candidates 3) apply the technologies of CRISP/CAS9 and gene over expression etc to identify the key factors during the process. The project is aimed at disclosing the key factors using the current platform of stem-cell-directed differentiation, and therefore providing the important data for development of stem cell-derived hepatocytes.

干细胞定向诱导肝向分化亟需完善，但受限于缺乏肝细胞特异的分子鉴定标记，由肝母细胞到成熟肝细胞过程中关键因子迄今未明。 申请人在前期工作中，稳定定向分化人胚胎干细胞为肝细胞 (hESC-Heps)，成功建立肝炎性病毒感染研究模型，真实的呈现了人原代肝细胞的特性。在此基础上，本项目将基于肝炎病毒的嗜肝性寻找hESC-Heps分化过程中关键因子： 1）稳定定向分化人胚胎干细胞获得肝细胞hESC-Hep，通过HBVpp/HCVpp系统和肝炎病毒的产生来筛选未成熟的和成熟的hESC-Heps；2）对筛选获得的hESC-Heps进行基因表达谱的比对分析获得候选因子；3）运用CRISP/CAS9基因敲除和高表达候选基因等技术确定hESC-Heps分化过程中关键因子。项目预期通过已建立的干细胞定向分化平台，揭示hESC-Heps分化过程中关键因子，为干细胞来源的肝细胞的发展完善提供重要参考依据。

缺乏稳定的肝细胞来源是限制肝细胞移植和生物人工肝临床应用的主要因素之一。人类胚胎干细胞(hESCs)具有高度的自我更新和全能性，是包括肝细胞在内的各种细胞系的潜在无限来源。已经开发了许多技术来有效地将hESCs分化为具有功能的肝细胞样细胞。然而，人胚胎干细胞来源的肝细胞样细胞(hESC-Heps在临床上的应用一直受到分化质量（纯度和成熟度）不高、完全分化细胞产量低、培养规模小、获取困难以及免疫移植物排斥反应等因素的限制。.针对以上问题，我们通过对hESC肝向分化过程中各个阶段的细胞高通量测序后对比分析，获得关键调控激酶因子，对DE分化过程进行调控，使hESCs向DE高效分化的同时阻断其向其他谱系分化，从而建立一种高效的定型内胚层细胞诱导方法，进而获得更成熟的且具有肝细胞功能的肝样细胞。该方法获得的hESC-Heps具有糖原积累、吲哚菁绿摄取和细胞色素P450酶活性等成熟肝细胞特征。此外，该方法获得的hESC-Heps具有良好的肝细胞功能，包括灵敏的天然免疫反应和可支持HBV感染，该方法获得hESC-Heps可作为宿主-病毒相互作用和肝毒性试验等研究的模型。.在2D分化体系的基础上，我们进一步发展了一种新型的3D分化系统，将分化处于DE阶段或肝祖细胞阶段的细胞包裹于藻酸盐-微囊化球体定向分化，获得低免疫排斥的即用型hESC-Heps。我们首次建立了一种利用藻酸盐微囊在三维微环境中培养和分化人胚胎干细胞为肝细胞的分化体系。我们的结果表明，3D藻酸盐分化获得的类肝细胞的成熟度和功能均优于2D平台分化的hESC-Heps，此外，海藻酸钠水凝胶制备的 3D微球还可有效阻断微球外的病毒颗粒进入微球与细胞受体结合，起到保护类肝细胞抗病毒感染的作用。该方法可能为今后获得可用于肝细胞移植、代谢性肝病治疗和肝衰竭氨昏迷用的肝细胞源打下坚实的基础。

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