β淀粉样蛋白寡聚体免疫影像学配体的制备及应用研究

Alzheimer's disease (AD) is the most common form of neurodegenerative disorder, which characterized with the build-up of misfolded β-amyloid (Aβ) in the brain. Mountaining evidences indicate that the oligomeric forms of Aβ are the triggering event in the AD progression, and the formation of Aβ oligomer far preceded the accumulation of Aβ plaques and other AD pathologies and symptoms. Imaging technique is the effective way of showing the pathological changes in the living AD brain. But we still can not monitor the neurotoxic Aβ oligomer level in the AD brain since lacking of Aβ oligomer specific ligand or tracer for Neuro-imaging techniques. In this study, we choose Aβ oligomer as target, and immunize Bactrian camel with the Aβ oligomers that synthesized in vitro to construct a Bactrian camel immune phage display antibody library, and select and prepare the single domain antibody specific for Aβ oligomers, as well as label the single domain antibody with Quantum dots to study its specific activity as an immuno-imaging ligand through live animal in vivo imaging in the AD transgenic mouse model Tg2576. The study will be foundamental for the development of clinical neuro-imaging ligand and immunotherapy agent, and meanwhile which is also great significant and wide applicable for the AD early diagnosis and treatment.

老年痴呆症（AD)是一类典型的神经退行性疾病，其主要的病理特征为β淀粉样蛋白(Aβ)在脑组织内的沉积。研究证据表明具有神经毒性的Aβ寡聚体的形成是AD病理过程中的始动环节，其出现要远早于Aβ斑块及AD其他的病理变化和症状，是AD早早期诊断的理想靶标。影像学方法是活体显示AD脑组织病理变化的有效手段。但由于缺乏有效针对Aβ寡聚体特异性的示踪剂和配体，目前仍无法监测AD脑组织中的Aβ寡聚体。在本课题中，我们以Aβ寡聚体为靶标，利用体外聚合制备的Aβ寡聚体免疫双峰驼，构建双峰驼免疫噬菌体抗体库，筛选和制备针对Aβ寡聚体特异性的单域抗体，并对其进行量子点标记，以AD转基因小鼠Tg2576为模型动物，通过活体动物荧光成像技术研究其作为免疫影像学配体的特性。该研究将为单域抗体开发成为神经影像学临床诊断所需配体和免疫治疗用抗体药物奠定基础，对AD的早早期诊断和治疗具有非常重要的意义和广阔的应用前景。

老年痴呆症（Alzheimer’s disease，AD）是慢性、进行性中枢神经系统变性导致的疾病。随着人口老龄化的增加，全球约有2000至2500万AD患者，其中美国400万，欧洲500万，中国600万。预计到2050年，美国将达到1400万，欧洲将超过1000万，而中国将超过1500万。Aβ蛋白学说认为从Aβ前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP）酶解产生的Aβ1-42多肽片段聚集形成的Aβ寡聚体（β-amyloid oligomers）是AD发病机制中的核心物质，它的形成是AD认知功能障碍和病理改变的始动环节。通过病理学研究和AD病人活体PET-CT脑成像研究显示，具有神经毒性的可溶性Aβ寡聚体在AD临床症状出现前的十年或更早的时期已经在患者脑组织中形成并影响脑的正常认知功能。因此，对于可溶性Aβ寡聚体的早期监测是有效预防和治疗AD的关键。. 本项目中我们通过体外聚合Aβ1-42肽制备可溶性Aβ寡聚体，得到主要以四聚体、五聚体形式存在，伴有少部分高分子量聚体。利用Aβ寡聚体对免疫双峰驼进行了七次免疫，最终获得双峰驼血清效价为1：10^6。以免疫后的双峰驼外周血淋巴细胞作为建库来源，构建了抗体库库容为2×10^6，多样性良好的噬菌体单域抗体库。利用Aβ寡聚体对抗体库进行了三轮富集和筛选，Phage ELISA鉴定获得了41株阳性克隆，并通过原核表达系统对其中的10株进行了成功的表达和纯化。重组单域抗体在ELISA检测试验中能够高亲和力的结合Aβ寡聚体。我们将Aβ寡聚体特异性单域抗体基因与生物发光蛋白Nano-luciferase基因进行了融合表达，融合蛋白对Aβ寡聚体能够特异性识别，为后续的动物活体成像鉴定脑内Aβ寡聚体奠定了基础，同时融合蛋白也能够开发成为基于生物发光的快速检测生物样本中Aβ寡聚体的含量的方法和试剂盒，对于AD的早早期诊断和治疗效果评价具有非常重要的意义，也具有广阔的应用前景。

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