鞘糖脂在生物膜上的空间分布对细菌毒素胞内运输的影响

Lipids is regarded as one of the indispensible components for plasma membrane. In eukaryotic cells, membrane are of well regulated environments that can provide a dynamic platform for various cellular processes (eg.material transport, energy transfer and signal endocytosis etc.). The plasma membrane are also characterized by high membrane heterogeneity including discrete membrane domains formed through the protein and lipid interactions. It is the vesicular trafficking that regulate and maintain the constant of protein and lipid contents and further keep the heterogeneous environment on eukaryotic cell membrane. However, the cell biology of glycosphingolipids is very little explored, notably due to the difficulty of imaging lipids. By chemical synthesis, we have obtained head group or carbohydrate-modified fluorescent species of the glycosphingolipids Gb3 or GM1, respectively. These lipids were functional as cellular receptors of two natural ligands from bacteria, the human pathogenic Shiga or Cholera toxins, allowing for toxin trafficking into cells. In this project, we plan to use advanced time and space resolved fluorescence anisotropy measurements on living cells to clarify the organizations of glycosphingolipids and toxin-glycosphingolipids complex on plasma membrane. Meanwhile, the small angle X-ray scattering technique is also used to reveal the heterogeneous environments on membrane. Briefly, our research interests would be focused on three aspects: 1) spatial distribution of glycosphingolipids itself; 2) spatial organizations of toxin-glycosphingolipid complex; 3) influence of cortical actin and cytoskeletons on the toxin-glycosphingolipid organizations on plasma membrane. Furthermore, the dynamics of toxins endocytosis process would be monitored through fluorescence recovery after photobleaching and fluorescence correlation spectroscopy approches. Our study aims at unraveling principles of glycosphingolipid organization at the plasma membrane in relation to endocytic toxin uptake into cells. Results of this study would of great significance both in theory and in practice.

脂类是生物膜结构的主要组分之一。许多重要的生物膜功能（如物质运输、能量转换及信号传递等）都与脂类在细胞膜上的分布相关。然而，脂类分布在生物膜发挥功能的作用机制尚不清楚，因而是当前研究的热点问题。本项目将以化学合成具有荧光标记的类鞘糖脂化合物作为研究对象，对鞘糖脂在生物膜上的空间分布及其特异性配体细菌毒素的胞内运输途径进行研究。我们将利用高效的荧光检测技术和小角X-射线散射技术研究鞘糖脂自身在活细胞生物膜上的空间分布情况、鞘糖脂结合细菌毒素后在生物膜上的分布情况，以及鞘糖脂和鞘糖脂-细菌毒素复合物与肌动蛋白和细胞骨架的相互影响。同时，通过活细胞荧光显微技术研究细菌毒素蛋白在不同反应条件下的胞内运输过程。通过本项目的研究，我们将为研究脂类分布在生物信号传递中的生理学机制建立技术平台，研究结果将为这一新兴领域的研究奠定一定的理论基础。

生物质膜表面特定的结构域，具有特殊的化学组成及特性，同时还富集了许多重要的信号传递分子，在细胞信号转导以及信号跨膜运输的过程中作用非常重要。其中，鞘糖脂就是一类与膜脂双层内微区的形成密切相关的脂类分子，在细胞信号传导过程中起着重要的作用。作为一类以鞘糖脂为特异性识别受体的AB5模式蛋白毒素，志贺氏菌毒素（Shiga toxin）的B亚基可以特异性识别靶细胞膜上的鞘糖脂受体球丙糖酰基鞘氨醇（globotriaosylceramide, Gb3或者CD77），引起志贺氏菌毒素B亚基分子在宿主细胞膜表面发生聚集，从而导致宿主细胞膜结构发生改变，向内形成管状凹陷，进而完成Shiga toxin具有毒素生化活性的A亚基在宿主细胞内的转运过程。本项目以Shiga toxin B亚基及其特异性受体Gb3为研究对象，采用由表及里的研究方法，围绕项目需要解决的关键科学问题开展了一系列研究工作。在实验方面：分别研究了细菌毒素特异性受体鞘糖脂自身在生物质膜表面的空间分布；细菌毒素-鞘糖脂复合物在生物质膜表面的空间分布；以及肌动蛋白与细胞骨架对生物质膜表面鞘糖脂以及细菌毒素-鞘糖脂复合物空间分布的影响三个层面。通过分析比较生物膜上具有生物活性的化学合成鞘糖脂在不同反应条件下的分布情况，阐明了膜脂对膜结构变化的作用机制，进而阐明了膜脂对细菌毒素在活细胞内信号转导通路的作用机制与调控机理。在理论方面：基于膜脂空间分布以及膜表面张力模型，构建了特异性针对膜脂检测的荧光共振能量转移（Homo-FRET）方法解析数学模型，该模型的建立被应用于鞘糖脂以及细菌毒素-鞘糖脂复合物在生物膜表面分布情况的模拟，取得了良好的效果。在平台建设方面，搭建了高时空分辨检测率的荧光检测平台以及液态生物样本小角X-射线散射技术平台，有效解决了膜脂成像以及空间尺度检测过程中的技术瓶颈，为开展膜脂、膜蛋白相关的课题研究奠定了技术基础。基于本项目的资助，目前已有2篇SCI论文撰写成文，投稿待审核。相关研究成果拟申请发明专利2项，投出待批复。

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