乳源低聚半乳糖糖库构建及其对小肠粘膜免疫的影响与构效关系研究

天然产物的某些特殊结构单元往往赋予其独特的生物活性。母乳喂养儿发育、健康状况及抵御疾病的能力均比人工喂养儿好，最新研究显示：母乳与畜乳显著区别之一是低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides,GOS)含高出畜乳20-300倍。GOS是在乳糖的半乳糖一侧以β(1-3)、β(1-4)或β(1-6)键结合1-4个半乳糖分子的活性低聚糖，其结构与生物活性的研究有助于从宏观生物资源和微观分子生物水平挖掘及开发新型生物资源。本研究利用酶法及益生菌发酵法制备GOS，对其进行分离和结构鉴定，挖掘结构新颖的GOS，构建乳源GOS糖库。人体内没有分解GOS的酶，它可以直接经过口腔、胃直达小肠及结肠，本课题定量、定位研究GOS对小肠粘膜免疫的影响，确定其对小肠粘膜免疫调节的量效、构效关系，从免疫学角度阐述其作用机理，为未来GOS在营养、健康及小肠粘膜预防免疫中的应用提供科技支撑。

本项目系统地研究了益生菌发酵法制备乳源低聚半乳糖（GOS）的工艺条件，对GOS进行含量测定、分离、纯化及结构鉴定，探讨GOS单一组分对小肠粘膜免疫系统的影响，以及乳源GOS及其酸乳产品对肌萎缩侧索硬化症（ALS）的治疗作用。项目研究主要得出如下结果：（1）益生菌发酵产生乳源GOS过程受到温度、发酵时间与接种量影响。最优发酵工艺条件为：保加利亚乳杆菌LB340与嗜热链球菌1:1进行复配，2‰接种量，37℃有氧发酵6h。该发酵条件下GOS产率达到2.032%，转化率高达29%。（2）含GOS发酵乳样品经过复合膜提纯和G-10色谱分离，得到了一个区段组分与一个较纯组分GOS-md。结构分析表明，乳源GOS主要是含有二聚糖和三聚糖，其单糖组分由葡萄糖和半乳糖组成，因此乳源GOS生成主要是益生菌发酵产生的乳糖酶水解乳糖，然后在发酵产物β-Galactosydases催化作用下将半乳糖转移到乳糖分子中，形成聚合度较低的低聚半乳糖。（3）肠上皮细胞（IEC）对肠粘膜在免疫应答中起重要作用，GOS-md对IEC细胞生长具有促增值作用，添加剂量为100 μg/mL时效果最明显，同时细胞因子IL-6分泌量达到最大。这说明GOS-md对改善小肠粘膜免疫系统具有一定的作用。（4）乳源GOS及其酸奶产品显著延缓SOD1G93A小鼠ALS疾病的发生和延长寿命，增加叶酸，维生素B12浓度和降低同型半胱氨酸的水平，减少脊髓前角运动神经元损伤，改善肌纤维线粒体功能，抑制了星形胶质细胞和小胶质细胞激活，影响了调节多种炎症和细胞凋亡相关因子的表达。（5）项目开发了富含GOS果粒发酵乳。最佳制备条件为：将8%黑布林和杏的果粒在65 ℃水浴，30 min巴氏消毒后添加到灭菌的复原脱脂乳中，按质量比为1∶1接种保加利亚乳杆菌 LB340和保加利亚乳杆菌 BB03，总接种量3‰，在42 ℃发酵10 h，产品中GOS达1.10%~1.40%。在4 ℃保藏14 d，产品黏度为0.74±0.25Pa•s，酸度为181.7±12.1 °T，pH值为4.15±0.06，活菌数达到1.50×1011~2.00×1015 mL-1，各项理化指标均符合发酵乳的国家标准。上述结果证实了益生菌发酵法制备的聚合度较低的GOS具有改善小肠粘膜预防免疫作用与治疗ALS作用，在增强人体免疫力功能性产品开发方向方面具有重要的应用。

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