甘蓝型油菜MEDIATOR16调控核盘菌寄主抗性的分子机理研究

Stem rot caused by the fungus Sclerotinia sclerotiorum is the most important disease of oilseed rape in China. It is an effective strategy to discover and utilize the molecular mechanism of basal resistance to protect host plants against the fungal pathogen. Previous work has shown that the MEDIATOR16（MED16） mutant is markedly susceptible to the fungus and MED16 is a key component of basal resistance. The present project will further explore the molecular mechanism of B. napus BnMED16 regulating host resistance against the fungus. Firstly, BnMED16 gene knockout and overexpression transgenic rape will be obtained by genetic transformation and the effects of rape BnMED16 protein on lignin content and H 2 O 2 levels in Brassica napus and its roles in host resistance of Sclerotinia sclerotiorum will be analyzed . Secondly, the interaction between MED16 and important transcription factors ORA59 and ERF1, which regulate Sclerotinia sclerotiorum, will be studied by yeast two hybrid and CO-IP techniques. This study will promote a better understanding of genetic cooperation between BnMED16 and TFs, and find the most effective transgenic combination activating host resistance.

油菜菌核病是由核盘菌导致的一种世界性真菌病害，也是我国最主要的一种油菜病害。解析寄主抗病分子机理，利用寄主本身抗性是解决病害问题的有效途径。前期研究发现拟南芥MEDIATOR16（MED16）是一个抵抗核盘菌侵染的重要因子。在核盘菌侵染过程中MED16可以激活相关抗性基因的表达，调控植物自身的寄主抗性。本研究拟进一步探索油菜BnMED16调控菌核病抗性的分子机理，通过遗传转化获得BnMED16 基因敲除和超表达的转基因油菜，分析油菜BnMED16 蛋白对油菜 木质 素 含量、H 2 O 2 水平的影响及其在核盘菌寄主抗性中所起的作用。并通过酵母双杂交和CO-IP技术研究MED16与调控菌核病的重要转录因子ORA59、ERF1的互作关系，弄清在核盘菌侵染过程中BnMED16激活寄主抗性基因的调控机制，为油菜抗菌核病育种提供理论依据和优良材料。

菌核病是油菜最主要的病害且防控困难，当前亟需筛选具有广谱抗性的因子并解析其抗病机理，为遗传改良和选育抗病品种提供新的种质资源和理论基础。植物受到病原菌侵染时体内将会接受指令从正常的生长发育转向防御反应信号途径，生物体会发生剧烈的转录组重编程过程，而中介因子复合体MED是参与这一过程的关键因子。本研究以甘蓝型油菜为主要研究对象，深入解析MED因子介导的油菜抗菌核病机理研究。研究结果将为油菜抗菌核病育种提供科学依据和种质资源。主要结果如下：1.对MED家族基因在油菜接菌后的表达模式进行分析，发现BnMED16基因表达被显著诱导。对过表达BnMED16的转化植株抗病鉴定发现，从病斑明显出现的24 hpi 开始，BnMED16(OE) 株系的病斑面积均显著小于WT。2 . 接菌前后BnMED16 基因的表达在BnMED16(OE) 中均显著高于 WT，且在6 hpi 和 48 hpi 时出现表达高峰，进一步说明了BnMED16 基因表达量的提高与油菜抗菌核病正相关。同时分析发现细胞壁合成相关基因BnGSL05）、BnPGIP）、BnPR2和BnPR3在BnMED16(OE) 中接菌前后的表达量均显著高于WT。3. 对转基因植株中SA、JA/ET 信号途径上的关键基因表达模式分析发现BnMED16 介导的油菜抗病在病原菌侵染早期同时激活SA和JA/ET 信号途径，但后期主要依赖于JA/ET信号途径。对0 hpi 和 48 hpi 叶片进行DAB染色和过氧化氢含量测定，结果表明BnMED16(OE) 在接菌后过氧化氢含量显著升高。超表达材料的木质素含量显著升高，对野生型Westar 和 BnMED16(OE) 植株进行茎秆活体接菌，结果表明BnMED16(OE)株系茎秆菌斑长度显著小于WT，说明BnMED16(OE) 株系细胞壁成分的改变可能引起了细胞壁抗性，从而增强了油菜植株对菌核病的抗性。4. 酵母双杂发现BnMED16 与 BnMED25有很强的体外互作，同时BiFC结果也进一步证明这些基因在体内也存在较强的互作，因此我们推断在油菜中，BnMED16 和BnMED25两个亚基可能需要形成一定的复合体激活抗病相关的转录因子介导油菜抗菌核病，或者是BnMED16需要以BnMED25为媒介来激活植物抗病信号途径。

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