基于脊髓肌肉萎缩症体外模型的药物筛选与机制研究

Spinal muscular atrophy (SMA) is the leading inherited disease, which causes death in infants and toddlers. Up to date, there is no cure for this devastating disease. Loss of function of survival motor neuron 1 (SMN1) gene and subsequent significant loss of full-length SMN (SMN-FL, comprising of Exon 7) cause selective loss of spinal motor neurons and paralysis of muscles. Although there is an extra SMN2 gene within the human genome due to genome replication during evolution, SMN2 only generates 10% SMN-FL and it mostly produces SMNdelta7 (a truncated form, lack of Exon 7). We hypothesize that small molecules could potentially increase the functional SMN protein, if they can either increase SMN2 gene transcription, increase Exon 7 splicing efficiency or stabilize SMNdelat7. In this application, we plan to build SMN2-Exon8-eGFP readout line through homologous recombination. The SMN2-Exon8-eGFP could faithfully represent the mRNA and protein levels of SMN2 delta7, or splicing bias of SMN2, and therefore could be used for high-throughput screening. Candidate hits will be further evaluated in our induced pluripotent stem cell based SMA disease model and transgenic mouse models. We expect to discover several candidate drugs which could potentially benefit SMA patients in the near future. Through this project, we also anticipate to identify a couple of mechanisms related to SMN2 transcription, SMNdelta7 degradation or SMN2 splicing.

脊髓肌肉萎缩症是引起儿童和青少年死亡的最常见遗传性疾病，没有治疗手段。SMN1基因的缺失突变，导致全长亚型SMN蛋白（SMN-FL）的减少，造成脊髓前角运动神经元的变性和死亡是SMA的唯一病因。虽然人类基因组中还存在由SMN1基因复制而来的SMN2基因，但是SMN2更多的是剪切产生缺失Exon7的不稳定的截短亚型（SMNdelta7），仅产生10% SMN-FL。我们设想如果能够筛选到合适的药物，提高SMN2基因的转录水平，增加SMN2剪切第7外显子的概率或者稳定SMNdelta7蛋白，就能增加功能性SMN蛋白总量，从而治愈SMA。在本申请中，基于我们在人多能干细胞向脊髓前角运动神经元定向分化、SMA疾病模拟、基因编辑等方面的技术优势，通过构建针对SMN2的各类报告系统，筛选增加功能性SMN的药物，研究药物的作用机制，并在病人来源运动神经元和小鼠模型中研究治疗前景。

脊髓肌肉萎缩症（SMA）是引起儿童和青少年死亡的最常见遗传性疾病，没有治疗手段。SMN1基因的缺失突变，导致全长亚型SMN蛋白（SMN-FL）的减少，造成脊髓前角运动神经元的变性和死亡是SMA的唯一病因。虽然人类基因组中还存在由SMN1基因复制而来的SMN2基因，但是SMN2更多的是剪切产生缺失Exon7的不稳定的截短亚型（SMNΔ7），仅产生10% SMN-FL。我们设 想如果能够筛选到合适的药物，提高SMN2基因的转录水平，增加SMN2剪切第7外显子的概率或者稳定SMNdelta7蛋白，就能增加功能性SMN蛋白总量，从而治愈SMA。本研究通过完善人类细胞中的基因编辑方案，通过CRISPR/Cas9介导的同源重组技术，在人类HEK293细胞中构建了一个多样性的SMN2-GFP和SMN2-Luciferase的报告系统，该系统可以用来定性定量分析SMN2基因的转录、剪切、翻译和蛋白质降解等生物学过程。通过SMN2-GFP和SMN2-Luciferase的报告细胞系，研究人员成功的在一个小分子化合物库中有效地筛选出了一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂Z-FA-FMK，它能够显著增加功能性的SMN蛋白约70%，并且能够改善SMA脊髓运动神经元中轴突线粒体的迁移与形态异常，从而抑制SMA脊髓运动神经元退变。同时研究人员也证明了，半胱氨酸蛋白酶CAPN1、CAPN7和CTSL调控了SMN-FL与SMN-Δ7蛋白的降解过程，为疾病的治疗提供了新的靶点。最后在SMNΔ7小鼠上证明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂Z-FA-FMK脑内给药可以有效延长SMNΔ7小鼠的寿命，而E64d由于能较好的通过血脑屏障，可以实现较长时间的外周给药，具有更好的动物模型治疗效果。研究证实了半胱氨酸蛋白酶系统是调控SMN蛋白降解的重要途径，并为SMA疾病的治疗提供了新的视角。.成果发表the EMBO J, Stem Cell Research and Therapy, Neurosci Bull, iScience，Stem Cells等论文8篇，申请专利1项，项目资助期间，申请人获国家人才计划资助，培养研究生5人，培养博士后1人。

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