己酮糖3-差向异构酶的构效关系与分子改造

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31171705
项目类别：
面上项目
资助金额：
63.0万
负责人：
沐万孟
依托单位：
江南大学
学科分类：
C2002.食品生物化学
结题年份：
2015
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2015-12-31

项目参与者：
张涛；周榴明；冯再平；贾敏；郁书怀；姜交龙；游栋；
关键词：
生物转化分子改造己酮糖3-差向异构酶稀有糖结构功能关系

项目摘要

稀有糖是碳水化合物研究新热点，己糖类稀有糖可依据己糖类单糖循环生物转化策略来获得最佳生物法制备途径，己酮糖3-差向异构酶是实现己糖类单糖循环转化的最基础的酶类，然而该酶类的底物特异性、热稳定性、弱酸稳定性等结构基础及功能改造等研究并不深入。本项目运用分子生物学、生物信息学及现代检测分析等方法，结合计算机模拟与突变研究技术，解析己酮糖3-差向异构酶的结构功能关系及催化机理，揭示己酮糖3-差向异构酶的底物特异性、热稳定性、弱酸稳定性及金属离子依赖性等机制；采用基于计算机模拟的分子设计或定点饱和突变技术结合高效筛选手段，实现己酮糖3-差向异构酶的定向改造与功能优化，以提高热稳定性及酶反应活力，改善底物特异性及弱酸稳定性，构建适用于单糖循环生物转化产业化应用的突变体酶，为碳水化合物资源开发利用提供新思路。

结项摘要

本项目利用分子生物学而技术，筛选到了几种新型的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶并进行了分子改造，研究结果概括如下：（1）通过分子克隆、表达纯化和性质鉴定，研究了来源于Clostridium sp. BNL1100、Desmospora sp. 8437和Treponema primitia ZAS-1等微生物DPEase的酶学性质与动力学参数；（2）研究酶学性质发现，重组Clostridium sp. DPEase、Desmospora sp. DPEase和T. primitia DPEase的最适pH分别为8.0、7.5和8.0；三种重组酶的最适温度分别为60 oC、65 oC和70 oC。三种酶均有较宽的pH作用范围（pH 6.0~9.0），并且在此pH范围内稳定性较好。重组酶对温度都比较敏感，50 oC以下时热稳定较好，但在60 oC进行温育时，重组酶很容易变性失去生物活性。这三种酶都是离子依赖型酶，只有Co2+存在时才能表现出催化活性。（3）三种重组酶的最适底物均为D-阿洛酮糖，当以D-阿洛酮糖为底物时，Clostridium sp. DPEase、Desmospora sp. DPEase和T. primitia DPEase的Km值分别为228、81和209 mM；当以D-果糖为底物时，它们的Km值分别为279、549和279 mM。（4）利用已有的晶体结构信息，利用SWISS-MODEL对C. bolteae DPEase酶单体的结构进行模拟，利用Discovery studio软件对C. bolteae DPEase酶和D-果糖进行对接，获得位于活性中心的关键氨基酸位点为Glu158，His188，Arg217，Glu152，Glu246，Y68和G109。突变结果表明，Glu152和Glu246为催化活性中心关键氨基酸，Glu158，His188和Arg217与底物结合有关，68和109位的氨基酸与底物识别有关，影响活性口袋的形成。并成功构建双突变体Y68I/G109P，该突变体酶对D-果糖的亲和能力更高，具有更好的热稳定性。该项目的开展对于己酮糖3-差向异构酶的结构与功能关系的阐明及该酶工业化应用提供必要的理论基础。在本基金项目资助下，已发表SCI论文25篇，获得授权发明专利2项，申请国家发明专利5项，荣获教育部科技进步二等奖1项。