金属硫蛋白2及其结合蛋白介导的针刺抗哮喘舒张气管平滑肌效应机制研究

This project is based on a clinically proven method for asthma and the research progress of the anti-asthmatic effect of acupuncture. Previous studies have shown that metallothionein 2 (MT-2) was one of the most important factors in asthma and acupuncture could significantly increase its expression. Preliminary experiments found that the MT-2 recombinant protein could reduce the airway resistance of asthmatic rat and relax the airway smooth muscle in a dose dependent manner. However, the relaxation effect was not related with the usual biological characteristics of MT-2, which suggested that the specific binding protein might exist on the surface of the airway smooth muscle cell. The study aims to test the biological functions of MT-2 in asthma from the aspects of animal model of asthma, isolated tracheal spiral model, and airway smooth muscle cell; use gene knockout mice to study the role of MT-2 in the pathogenesis of asthma and the regulation mechanism of acupuncture; after confirmation of the binding protein of MT-2, the downstream signaling pathways and the potential mechanism will be discussed. The study will scientifically explain the biological basis of the anti-asthmatic effect of acupuncture, and may provide new targets and regulation mechanism for airway smooth muscle contraction in asthma.

本项目建立在临床有效的针刺治疗方法和前期针刺抗哮喘效应物质基础研究有所发现基础之上。利用基因组学技术发现金属硫蛋白2(MT-2)是重要的针刺抗哮喘差异表达因子，且针刺能显著提高该蛋白在哮喘中表达。预初研究表明MT-2重组蛋白具有一定剂量范围内降低哮喘大鼠气道阻力和舒张气管平滑肌细胞作用，且该效应与MT-2已知生物学特性无关，提示MT-2在气管平滑肌细胞表面可能存在相应结合蛋白。本项目拟从哮喘动物模型、离体气管螺旋条模型、气管平滑肌细胞等层面研究MT-2蛋白对哮喘呼吸功能和气管平滑肌收缩舒张功能影响；利用基因敲除小鼠，研究MT-2在哮喘发病和针刺抗哮喘效应中的关键作用；寻找并确定MT-2在气管平滑肌细胞表面可能的结合蛋白，明确MT-2舒张气管平滑肌效应下游信号通路和潜在机制，从而科学地阐释针刺抗哮喘作用生物学内涵，为哮喘气管平滑肌收缩舒张功能提供新的调控靶点和机制。

前期课题组通过分析针刺抗哮喘大鼠肺组织基因表达连续分析标签数据库，明确金属硫蛋白2(MT-2)是针刺抗哮喘差异表达因子之一。本项目通过基因克隆、蛋白表达和纯化技术获得毫克级MT-2重组蛋白。在1-1000ng/kg浓度范围内，MT-2可显著降低哮喘大鼠模型气道阻力、改善呼吸功能，且呈现剂量依赖关系。在100-800ng/ml浓度范围内，MT-2可显著舒张大鼠离体气管螺旋条，且呈现剂量依赖关系。在100-800ng/ml浓度范围内，利用偏振光立体成像法等方法证明MT-2可显著舒张大鼠气道平滑肌细胞。基因敲除小鼠哮喘模型气道阻力显著增加，证明MT-2在哮喘发病中起关键作用。进一步确定MT-2在气道平滑肌细胞上的受体是肌动蛋白结合蛋白2(Transgelin-2)，并利用放射受体分析、激光共聚焦、表面等离子共振等方法验证。利用磷酸化芯片技术在分子机制上阐明MT-2蛋白可通过降低肌球蛋白磷酸酶活性关键调节亚单位MYPT1磷酸化水平实现气道平滑肌舒张。上述研究结果Transgelin-2 as a therapeutic target for asthmatic pulmonary resistance以封面文章形式发表在Science Translational Medicine杂志(2018;10(427):eaam8604，课题负责人为第一作者)。国际著名评论期刊Nature Reviews Drug Discovery以Alternative route to airway relaxation为题详细点评了团队此项工作(Nat Rev Drug Discov 2018;17:241)。该成果也被国家自然科学基金委员会在资助成果中报道(医学科学部，2018年3月7日)，并指出Transgelin-2蛋白是我国学者发现并验证的第一个支气管哮喘新靶标。本项目从组学技术出发，应用当代生物技术阐释针刺抗哮喘生物学机制，对保持我国在针灸研究领域的国际领先地位，率先在针灸研究领域拥有原创性的自主知识产权具有重要的战略意义，同时为哮喘治疗创新药物发展提供新的研究思路。

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