利用斑马鱼胚胎及其胚胎细胞研究羧基化单壁碳纳米管的生物毒性及其机制

Toxicity of nanomaterials and its effect on Environment have been paid great attention to by scientists and governments. Our research in early days showed that SWNTs mainly distributed in the lysosome of cells, and lots of vacuoles were formed in the cells, revealing that carbnon nanotubes could cause autophagy and lysosomal dysfunction. Due to the stability of SWNTs, here we have two questions: ①SWNTs can not be effectively degraded and cleared, and will accumulate in lysosomes, resulting in chronic toxicity.②Lysosome can remove the functional groups on the surface of SWNTs. Here we plan to evaluate the SWNT-COOH biotoxicity and study its mechanism by employing zebrafish embryos and embryonic cells, particulary, to focus on the effect of SWNTs on lysosome.Our work will provide toxicity evaluation and proposal strategies to reduce carbon nanotubes toxicity.

随着纳米科技的迅速发展，纳米材料的毒性和对环境的影响已经引起科学界和政府有关部门的重视。我们前期的工作观测到单壁碳纳米管与细胞孵育后主要分布于溶酶体中，细胞内部出现大量空泡，提示碳纳米管可能诱导自噬和溶酶体机能失常。由于碳纳米管结构较稳定，于是我们提出了两个假设： ①溶酶体无法有效降解单壁碳纳米管，造成碳纳米管大量积聚于溶酶体，引起长期毒性作用；②溶酶体对碳纳米管的表面修饰具有去修饰作用。因此，本项目拟利用斑马鱼胚胎及其胚胎细胞对羧基化单壁碳纳米管的生物毒性及其毒性机制进行研究，重点围绕单壁碳纳米管对溶酶体造成的影响，以及与此相关的单壁碳纳米管的短期毒性和慢性毒性作用进行研究，为单壁碳纳米管的研究和应用提供科学依据。

研究背景：碳纳米管（CNTs）在纳米药物载体、疾病诊断以及肿瘤光热治疗等生物医学方面的应用研究取得了大量进展。与此同时，CNTs的生物安全性评价也受到了极大关注，研究表明，CNTs的可能毒性机制主要包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和自噬性细胞死亡等，但尚未获得完全阐明；另外，对CNTs进行表面修饰能否有效降低毒性仍需进一步的研究予以证实。本项目完成的主要研究内容有：（1）以药浴暴露染毒法评价了羧基化单壁碳纳米管（SWNT-COOH）对有/无绒毛膜保护的斑马鱼胚胎的毒性效应，包括畸形率、死亡率、炎症反应、骨骼发育相关基因表达、胃肠道消化功能等；（2）采用卵黄囊注射染毒法评价了SWNT-COOH对斑马鱼幼鱼免疫毒性和肝脏毒性的影响；（3）以大鼠肝星状HSC-T6细胞作为受试对象，研究SWNT-COOH对线粒体和溶酶体的损伤作用及由此引发的ROS；（4）研究了SWNT-COOH的生物毒性作用分子机制，包括自噬相关信号通路和凋亡相关信号通路。重要成果：（1）SWNT-COOH药浴暴露染毒对斑马鱼胚胎发育的畸形率、死亡率、炎症细胞因子（TNF-α和IL-1β）和骨骼发育相关基因BMP-2b、BMP4、runx-2a和runx-2b等mRNA的相对表达量无显著影响；斑马鱼幼鱼吞食SWNT-COOH会影响肠道微绒毛形态和密度，但对胃肠道消化功能无显著影响。（2）采用卵黄囊注射SWNT-COOH对斑马鱼幼鱼未产生显著的免疫毒性，中性粒细胞的数量未增多、趋化作用亦未增强；但会引起一定的肝脏毒性，当注射剂量达到24ng/尾时肝脏面积受到显著抑制，卵黄囊吸收明显延缓。（3）SWNT-COOH能够抑制HSC-T6细胞的增殖，其原因可能为SWNT-COOH会损伤线粒体和溶酶体并引起氧化应激。（4）SWNT-COOH表面修饰的酪蛋白会被细胞降解。（5）SWNT-COOH能够上调自噬相关基因atg10和Beclin1等mRNA的表达，通过抑制AKT和mTOR的磷酸化来激活细胞的自噬相关信号通路，同时诱导自噬相关蛋白LC3 I型向II型转化，因此，SWNT-COOH的毒性作用可能与其诱导的细胞自噬作用有关。意义：本项目的研究证实了水体环境中和体内注射的SWNT-COOH对斑马鱼的毒性作用，初步阐明了SWNT-COOH生物毒性效应的作用机制，为CNTs在生物医学等方面的应用提供毒性依据。

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